Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van gen knock-outs die embryonaal dodelijk zijn in vivo in genetisch gemanipuleerde muismodel-afgeleide tumoren en vervolgens het effect beoordelen dat de knock-out heeft op tumorgroei, proliferatie, overleving, migratie, invasie en het transcriptoom in vitro en in vivo.
De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen die zich precies richten op belangrijke eiwitten in menselijke kankers, verandert fundamenteel de kankertherapieën. Voordat deze geneesmiddelen echter kunnen worden gebruikt, moeten hun doeleiwitten worden gevalideerd als therapeutische doelen in specifieke kankertypen. Deze validatie wordt vaak uitgevoerd door het gen dat codeert voor het kandidaat-therapeutische doelwit uit te schakelen in een genetisch gemanipuleerd muismodel (GEM) van kanker en te bepalen welk effect dit heeft op tumorgroei. Helaas beperken technische problemen zoals embryonale letaliteit in conventionele knock-outs en mozaïcisme in voorwaardelijke knock-outs deze aanpak vaak. Om deze beperkingen te overwinnen, werd een benadering ontwikkeld voor het aborteren van een gevlokt embryonaal dodelijk gen van belang in kortetermijnculturen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST’s) gegenereerd in een GEM-model.
Dit artikel beschrijft hoe een muismodel met het juiste genotype kan worden vastgesteld, tumorculturen op korte termijn van deze dieren kunnen worden afgeleid en vervolgens het gevloste embryonale letale gen kan worden afgezwakt met behulp van een adenovirale vector die Cre-recombinase en verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP) tot expressie brengt. Zuivering van cellen getransduceerd met adenovirus met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en de kwantificering van de effecten die genablatie uitoefent op cellulaire proliferatie, levensvatbaarheid, het transcriptoom en orthotopische allograftgroei wordt vervolgens gedetailleerd beschreven. Deze methodologieën bieden een effectieve en generaliseerbare benadering voor het identificeren en valideren van therapeutische doelen in vitro en in vivo. Deze benaderingen bieden ook een hernieuwbare bron van tumor-afgeleide cellen met een lage passage met verminderde in vitro groeiartefacten. Hierdoor kan de biologische rol van het beoogde gen worden bestudeerd in diverse biologische processen zoals migratie, invasie, metastase en intercellulaire communicatie gemedieerd door het secretoom.
Vóór de laatste twee decennia was de behandeling van menselijke kankers sterk afhankelijk van radiotherapie en chemotherapeutische middelen die zich breed richtten op snel woekerende cellulaire populaties door DNA te beschadigen of DNA-synthese te remmen. Hoewel deze benaderingen de groei van kankercellen remden, hadden ze ook schadelijke bijwerkingen op normale snel prolifererende celtypen zoals intestinale epitheelcellen en haarfollikelcellen. Meer recent is kankertherapie begonnen met het gebruik van chemotherapeutische middelen die zich precies richten op eiwitten binnen signaalroutes die van cruciaal belang zijn voor de groei van het neoplasma van een individuele patiënt. Deze aanpak, gewoonlijk aangeduid als “Precision Medicine”, heeft geleid tot de ontwikkeling van een steeds groter wordend repertoire van monoklonale antilichamen en kleine moleculaire remmers. Deze middelen remmen effectief de proliferatie en overleving van tumorcellen, terwijl ze de schadelijke bijwerkingen op normale celtypen vermijden die worden gezien met conventionele chemotherapeutische middelen en radiotherapie. Monoklonale antilichamen die worden gebruikt voor de behandeling van menselijke kankers richten zich meestal op celoppervlakmoleculen zoals groeifactorreceptoren1 (bijv. de grote familie van membraanoverspannende receptor tyrosinekinasen) en immuunresponsmodulatoren2 (bijv. geprogrammeerd celdoodeiwit 1, geprogrammeerd doodsligand 1). Kleine moleculaire remmers kunnen celoppervlakeiwitten of signaaleiwitten remmen die zich intracellulair bevinden3. Om deze nieuwe therapeutische middelen effectief te gebruiken, moet echter worden vastgesteld dat een bepaalde kanker afhankelijk is van het molecuul dat het doelwit is van een kandidaat-therapeutisch middel.
Hoewel deze nieuwe therapeutische middelen meer gerichte effecten hebben, remmen veel van hen nog steeds de werking van meer dan één eiwit. Bovendien zijn er vaak meerdere middelen met verschillende effectiviteit en specificiteit beschikbaar om zich op een specifiek eiwit te richten. Daarom is het tijdens preklinisch onderzoek verstandig om aanvullende benaderingen zoals genetische ablatie te gebruiken om een kandidaat-eiwit als therapeutisch doelwit te valideren. Een bijzonder nuttige benadering voor het valideren van een eiwit als een therapeutisch doelwit is om het gen dat codeert voor het kandidaat-eiwit af te breken in een genetisch gemanipuleerd diermodel dat het specifieke type kankerinteresse ontwikkelt. Deze aanpak kan relatief eenvoudig zijn als muizen met een nulmutatie (ofwel een natuurlijke mutatie, een genetisch gemanipuleerde nulmutatie [een “knock-out”], of een nulmutatie geïntroduceerd door een genenval) beschikbaar zijn en de muizen levensvatbaar zijn in de volwassenheid. Helaas zijn muizen met een nulmutatie die aan deze criteria voldoen vaak niet beschikbaar, meestal omdat de nulmutatie embryonaal of in de eerste dagen van het postnatale leven resulteert in de dood. In deze omstandigheid kunnen muizen die vatbaar zijn voor het ontwikkelen van het tumortype van interesse in plaats daarvan worden gekruist met muizen waarin belangrijke segmenten van het gen van belang worden geflankeerd door loxP-sites (“floxed”), waardoor het gen kan worden gelateld door een transgen te introduceren dat Cre-recombinase tot expressie brengt in de tumorcellen (een voorwaardelijke knock-out). Deze aanpak biedt verschillende voordelen. Ten eerste, als er een Cre-driver beschikbaar is die tot expressie komt in de tumor, maar niet in het celtype dat tot de dood heeft geleid in conventionele knock-outs, kan deze aanpak mogelijk het kandidaat-therapeutische doelwit valideren. Ten tweede stelt het aborteren van het gen dat codeert voor het kandidaat-eiwit in tumorcellen, maar niet in andere intratumorale elementen zoals tumor-geassocieerde fibroblasten of immuuncellen, de onderzoeker in staat om onderscheid te maken tussen cel-autonome en niet-cel-autonome effecten van het therapeutische doelwit. Ten slotte stelt een tamoxifen-induceerbare Cre-driver (CreERT2) de onderzoeker in staat om het gen van belang in verschillende stadia van tumorontwikkeling te verwijderen en het venster te definiëren waarin het kandidaat-therapeutische middel het meest waarschijnlijk effectief is.
Helaas zijn er ook technische problemen die het gebruik van voorwaardelijke knock-outs in tumoren die ontstaan in GEM-modellen kunnen beperken. Een Cre-driver die bijvoorbeeld tot expressie komt in tumorcellen en gendeletie in normale cellen die essentieel zijn voor het leven vermijdt, is mogelijk niet beschikbaar. Een ander probleem, dat misschien wordt onderschat, is dat Cre- en CreERT2-drivers vaak variabel floxed allelen bij muizen aborteren, wat resulteert in mozaïcisme voor de nulmutatie in een GEM-kanker. Wanneer dit gebeurt, zullen tumorcellen waarin het beoogde gen niet is geableerd, zich snel blijven vermenigvuldigen en de tumorcellen overwoekeren met geableerde allelen. Mozaïcisme in Cre-driverlijnen kan optreden als gevolg van niet-alomtegenwoordige Cre-expressie in de beoogde afstamming en door mislukte recombinatie in individuele cellen onafhankelijk van Cre-expressie4. Dit is een bekend fenomeen van Cre-drivers dat afhankelijk is van het celtype en waarmee rekening moet worden gehouden tijdens experimenteel ontwerp en gegevensinterpretatie. Mozaïcisme kan het effect van de knock-out maskeren en ertoe leiden dat een onderzoeker ten onrechte concludeert dat het gen van belang niet essentieel is voor de proliferatie en / of overleving van tumorcellen en dus geen geldig therapeutisch doelwit is.
Verschillende van deze problemen werden aangetroffen in een eerdere studie die probeerde te bepalen of de receptor tyrosinekinase erbB4 een potentieel therapeutisch doelwit was in MPNST-cellen5. In deze studies werden muizen gebruikt die een transgen tot expressie brengen dat codeert voor de neureguline-1 (NRG1) isoforme gliagroeifactor-β3 (GGFβ3) onder controle van de Schwann-celspecifieke myeline-eiwit nulpromotor (P 0-GGFβ3-muizen). P 0-GGFβ3-muizen ontwikkelen multipele plexiforme neurofibromen die zich ontwikkelen tot MPNT’s via een proces dat de processen van neurofibromapathogenese en plexiforme neurofibroma-MPNST-progressie recapituuleert die wordt gezien bij patiënten met het autosomaal dominante tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1)6. Bij kruising met muizen met een Trp53 null-mutatie, de resulterende P 0-GGFβ3; Trp53+/- muizen ontwikkelen MPNSTs de novo zoals wordt gezien bij cis-Nf1+/-; Trp53+/- muizen.
Deze MPNT’s recapituleren de progressie van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) graad II naar WHO graad IV laesies gezien bij mensen7. Bij P 0-GGFβ3-muizen ontstaan MPNST’s binnen reeds bestaande plexiforme neurofibromen in de trigeminuszenuw (58%) en spinale dorsale zenuwwortels (68%)7; de MPNST’s die in P 0-GGFβ3 voorkomen; Trp53+/- muizen hebben een zeer vergelijkbare verdeling. Bij mensen komen MPNST’s meestal voor in de heupzenuw, gevolgd door de brachiale plexus, spinale zenuwwortels, vagus, femorale, mediane, sacrale plexus, popliteale obturator en achterste tibiale en ulnaire zenuwen8. Deze tumorverdeling in deze GEM-modellen is enigszins anders dan wat bij mensen wordt gezien. Echter, de MPNST’s die ontstaan in P 0-GGFβ3 en P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen zijn histologisch identiek aan menselijke MPNST’s, dragen veel van dezelfde mutaties als in menselijke MPNST’s en recapituleren het proces van neurofibroma-MPNST-progressie dat wordt gezien bij NF1-patiënten. De generatie van P 0-GGFβ3 of P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen die Erbb4-/- waren, was niet haalbaar omdat muizen met twee Erbb4 nul-allelen sterven in utero op embryonale dag 10,5 secundair aan hartafwijkingen9. Omdat het redden van Erbb4-expressie in het hart door het introduceren van een hartspecifiek Erbb4-transgen (α-myosine zware keten (MHC)-Erbb4) resulteert in levensvatbare Erbb4-/- muizen10, de generatie muizen met een gecompliceerde P0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotype werd geprobeerd.
De paringen produceerden echter geen muizen in de verwachte Mendeliaanse verhoudingen, wat aangeeft dat het gewenste genotype schadelijk was. Daarom de generatie van P 0-GGFβ3; Trp53+/- muizen met gevlokte Erbb4-allelen 11 en een CreERT2-driver werd geprobeerd de deletie van Erbb4 in de MPNGT’s die bij deze muizen ontstaan toe te staan. Bij deze dieren waren nog talrijke tumorcellen met intacte Erbb4-allelen aanwezig (mozaïcisme). Het waargenomen mozaïcisme kan het gevolg zijn van inefficiënte tamoxifenafgifte, wat resulteerde in verschillen in recombinatie-efficiëntie in het weefsel. De mogelijkheid van spontane compenserende mechanismen zou verder kunnen bijdragen aan mozaïcisme in tamoxifen-gemedieerde recombinatie door de vereiste voor Erbb4-expressie te omzeilen. Het is mogelijk dat het verlies van Trp53 tumorcellen vatbaar maakt voor extra spontane “permissieve” mutaties die de interpretatie van de gegevens kunnen verwarren. Omdat het waarschijnlijk leek dat de Erbb4-intacte MPNST-cellen de gevolgen van het aborteren van Erbb4 in andere tumorcellen zouden maskeren, werd deze aanpak verlaten.
Deze obstakels leidden tot de ontwikkeling van een methodologie voor het aborteren van Erbb4 in mpnst-cellen met een adenovirus dat Cre-recombinase en eGFP tot expressie brengt. Deze cellen kunnen worden gescheiden van niet-geïnfecteerde cellen met behulp van FACS, wat het mozaïcisme voor het ablated Erbb4-gen aanzienlijk vermindert. Hieronder worden de methoden beschreven die worden gebruikt om dit te bereiken, samen met de methoden die worden gebruikt om de effecten van genablatie in vitro en in vivo te beoordelen. Het volgende protocol is een voorbeeld van het produceren van tumordragende muizen die tumoren opleveren met gevlokte allelen van embryonale letale genen die van belang zijn voor ex vivo excisie voorafgaand aan in vivo allograft tumorgroeibeoordeling. Dit omvat een beschrijving van de benaderingen die worden gebruikt om het effect te analyseren dat Erbb4-ablatie uitoefent op tumorcelproliferatie, overleving en genexpressie in vitro en proliferatie, overleving en angiogenese bij orthotopische allografts.
De hier gepresenteerde gedetailleerde methoden zijn ontwikkeld met behulp van een GEM-model van MPNST’s. Als het tumorweefsel van belang echter kan worden verspreid in individuele cellen, zijn deze methoden gemakkelijk aan te passen voor verschillende tumortypen die in GEMs ontstaan. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het gevlochten allel niet resulteert in i) verminderde overleving die het moeilijk kan maken om voldoende muizen te verkrijgen om te screenen op tumoren, of ii) verhoogde tumorlatentie die het moeili…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), het National Cancer Institute (R01 CA122804), het Ministerie van Defensie (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-1-1-0073 en W81XWH-15-1-0193) en The Children’s Tumor Foundation (2014-04-001 en 2015-05-007).
Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
CD31 | Abcam | ab28364 | |
Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |