Définition des fonctions géniques dans la tumorigenèse par ablation ex vivo d’allèles floxés dans des cellules tumorales malignes de la gaine nerveuse périphérique

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des knockouts génétiques qui sont létaux embryonnaires in vivo dans des tumeurs génétiquement modifiées dérivées de modèles murins, puis évaluer l’effet que le knockout a sur la croissance tumorale, la prolifération, la survie, la migration, l’invasion et le transcriptome in vitro et in vivo.

Abstract

Le développement de nouveaux médicaments qui ciblent précisément les protéines clés dans les cancers humains modifie fondamentalement les thérapies anticancéreuses. Cependant, avant que ces médicaments puissent être utilisés, leurs protéines cibles doivent être validées en tant que cibles thérapeutiques dans des types de cancer spécifiques. Cette validation est souvent effectuée en éliminant le gène codant pour la cible thérapeutique candidate dans un modèle de cancer de souris génétiquement modifiée (GEM) et en déterminant l’effet que cela a sur la croissance tumorale. Malheureusement, des problèmes techniques tels que la létalité embryonnaire dans les knockouts conventionnels et le mosaïcisme dans les knockouts conditionnels limitent souvent cette approche. Pour surmonter ces limites, une approche d’ablation d’un gène létal embryonnaire floxé d’intérêt dans des cultures à court terme de tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) générées dans un modèle GEM a été développée.

Cet article décrit comment établir un modèle murin avec le génotype approprié, dériver des cultures tumorales à court terme de ces animaux, puis ablation du gène létal embryonnaire floxé à l’aide d’un vecteur adénoviral qui exprime la Cre recombinase et la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). La purification des cellules transduites avec l’adénovirus à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la quantification des effets que l’ablation génique exerce sur la prolifération cellulaire, la viabilité, le transcriptome et la croissance de l’allogreffe orthotopique sont ensuite détaillées. Ces méthodologies fournissent une approche efficace et généralisable pour identifier et valider des cibles thérapeutiques in vitro et in vivo. Ces approches fournissent également une source renouvelable de cellules dérivées de tumeurs à faible passage avec des artefacts de croissance in vitro réduits. Cela permet d’étudier le rôle biologique du gène ciblé dans divers processus biologiques tels que la migration, l’invasion, les métastases et la communication intercellulaire médiée par le sécrétome.

Introduction

Avant les deux dernières décennies, le traitement des cancers humains reposait fortement sur la radiothérapie et les agents chimiothérapeutiques qui ciblaient largement les populations cellulaires proliférant rapidement en endommageant l’ADN ou en inhibant la synthèse de l’ADN. Bien que ces approches aient inhibé la croissance des cellules cancéreuses, elles ont également eu des effets secondaires délétères sur des types cellulaires normaux qui prolifèrent rapidement, tels que les cellules épithéliales intestinales et les cellules du follicule pileux. Plus récemment, le traitement du cancer a commencé à utiliser des agents chimiothérapeutiques qui ciblent précisément les protéines dans les voies de signalisation qui sont d’une importance cruciale pour la croissance du néoplasme d’un patient individuel. Cette approche, communément appelée « médecine de précision », a conduit au développement d’un répertoire sans cesse croissant d’anticorps monoclonaux et de petits inhibiteurs moléculaires. Ces agents inhibent efficacement la prolifération et la survie des cellules tumorales tout en évitant les effets secondaires délétères sur les types de cellules normales observés avec les agents chimiothérapeutiques conventionnels et la radiothérapie. Les anticorps monoclonaux utilisés pour le traitement des cancers humains ciblent le plus souvent des molécules de surface cellulaire telles que les récepteurs du facteur de croissance¹ (p. ex., la grande famille des tyrosine kinases du récepteur membranaire) et les modulateurs de la réponse immunitaire² (p. ex., protéine de mort cellulaire programmée 1, ligand de mort programmé 1). Les petits inhibiteurs moléculaires peuvent inhiber soit les protéines de surface cellulaire, soit les protéines de signalisation situées intracellulairement³. Cependant, pour utiliser efficacement ces nouveaux agents thérapeutiques, il faut établir qu’un cancer particulier dépend de la molécule ciblée par un agent thérapeutique candidat.

Bien que ces nouveaux agents thérapeutiques aient des effets plus ciblés, beaucoup d’entre eux inhibent encore l’action de plus d’une protéine. De plus, plusieurs agents avec une efficacité et une spécificité variables sont souvent disponibles pour cibler une protéine spécifique. Par conséquent, lors des investigations précliniques, il est judicieux d’utiliser des approches supplémentaires telles que l’ablation génétique pour valider une protéine candidate comme cible thérapeutique. Une approche particulièrement utile pour valider une protéine en tant que cible thérapeutique consiste à ablation du gène codant pour la protéine candidate dans un modèle animal génétiquement modifié qui développe le type de cancer spécifique d’intérêt. Cette approche peut être relativement simple si des souris porteuses d’une mutation nulle (soit une mutation naturelle, une mutation nulle génétiquement modifiée [un « knockout»], ou une mutation nulle introduite par un piège génétique) sont disponibles et que les souris sont viables à l’âge adulte. Malheureusement, les souris avec une mutation nulle qui répondent à ces critères ne sont souvent pas disponibles, généralement parce que la mutation nulle entraîne la mort embryonnaire ou dans les premiers jours de la vie postnatale. Dans cette circonstance, les souris sujettes à développer le type de tumeur d’intérêt peuvent plutôt être croisées avec des souris dans lesquelles des segments clés du gène d’intérêt sont flanqués de sites loxP (« floxed »), ce qui permet au gène d’être ablée en introduisant un transgène exprimant la Cre recombinase dans les cellules tumorales (un knockout conditionnel). Cette approche offre plusieurs avantages. Tout d’abord, si un pilote de Cre est disponible qui est exprimé dans la tumeur mais pas dans le type de cellule qui a conduit à la mort dans les knockouts conventionnels, cette approche peut potentiellement valider la cible thérapeutique candidate. Deuxièmement, l’ablation du gène codant pour la protéine candidate dans les cellules tumorales mais pas dans d’autres éléments intratumoraux tels que les fibroblastes associés à la tumeur ou les cellules immunitaires permet à l’investigateur de distinguer les effets autonomes cellulaires et non autonomes de la cible thérapeutique. Enfin, un pilote cre inductible au tamoxifène (CreER^T2) permet à l’investigateur de supprimer le gène d’intérêt à différents stades du développement tumoral et de définir la fenêtre dans laquelle l’agent thérapeutique candidat est le plus susceptible d’être efficace.

Malheureusement, il existe également des problèmes techniques qui peuvent limiter l’utilisation de knockouts conditionnels dans les tumeurs survenant dans les modèles GEM. Par exemple, un facteur cre qui est exprimé dans les cellules tumorales et évite la délétion de gènes dans les cellules normales essentielles à la vie peut ne pas être disponible. Un autre problème, qui peut être sous-estimé, est que les pilotes Cre et CreER^T2 ablatent souvent de manière variable les allèles floxés chez la souris, ce qui entraîne un mosaïcisme pour la mutation nulle dans un cancer GEM. Lorsque cela se produit, les cellules tumorales dans lesquelles le gène ciblé n’a pas été ablation continueront à proliférer rapidement, envahissant les cellules tumorales avec des allèles ablés. Le mosaïcisme dans les lignes pilotes de Cre peut se produire en raison de l’expression non omniprésente de Cre dans la lignée ciblée et par l’échec de la recombinaison dans des cellules individuelles indépendantes de l’expression de Cre⁴. Il s’agit d’un phénomène connu des facteurs de Cre qui dépend du type cellulaire et doit être pris en compte lors de la conception expérimentale et de l’interprétation des données. Le mosaïcisme peut masquer l’effet de l’assommage et amener un chercheur à conclure à tort que le gène d’intérêt n’est pas essentiel à la prolifération et/ou à la survie des cellules tumorales et n’est donc pas une cible thérapeutique valide.

Plusieurs de ces problèmes ont été rencontrés dans une étude précédente qui tentait de déterminer si le récepteur tyrosine kinase erbB4 était une cible thérapeutique potentielle dans les cellules MPNST⁵. Dans ces études, des souris ont été utilisées qui expriment un transgène codant pour le facteur de croissance gliale isoforme neuréguline-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) sous le contrôle du promoteur zéro de la protéine de myéline spécifique à la cellule de Schwann (souris P 0-GGFβ3). Les souris P 0-GGFβ3 développent plusieurs neurofibromes plexiformes qui progressent pour devenir des MPNST via un processus qui récapitule les processus de pathogenèse du neurofibrome et de progression du neurofibrome plexiforme-MPNST observé chez les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1)⁶. Lorsqu’il est croisé avec des souris avec une mutation nulle Trp53, le P 0-GGFβ3 résultant; Les souris Trp53^+/- développent des MPNST de novo comme on le voit dans cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- souris.

Ces MPNST récapitulent la progression des lésions de grade II de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) aux lésions de grade IV de l’OMS observées chez l’homme⁷. Chez les souris P 0-GGFβ3, les MPNST apparaissent dans les neurofibromes plexiformes préexistants dans le nerf trijumeau (58%) et les racines du nerf dorsal spinal (68%)⁷; les MPNST apparaissant dans P 0-GGFβ3; Les souris Trp53^+/- ont une distribution très similaire. Chez l’homme, les MPNST surviennent le plus souvent dans le nerf sciatique, suivi du plexus brachial, des racines du nerf spinal, du vagus, du fémur, de la médiane, du plexus sacré, de l’obturateur poplité et des nerfs tibia et ulnaire postérieurs⁸. Cette distribution tumorale dans ces modèles GEM est quelque peu différente de ce qui est vu chez l’homme. Cependant, les MPNST qui apparaissent dans P 0-GGFβ3 et P_0-GGFβ3; Les souris Trp53^+/- sont histologiquement identiques aux MPNST humains, portent bon nombre des mêmes mutations observées chez les MPNST humains et récapitulent le processus de progression du neurofibrome-MPNST observé chez les patients NF1. La génération de P 0-GGFβ3 ou P_0-GGFβ3; Trp53^+/- souris qui étaient Erbb4^-/- n’était pas faisable car les souris avec deux allèles nuls Erbb4 meurent in utero au jour embryonnaire 10,5 secondaire à des malformations cardiaques⁹. Parce que sauver l’expression d’Erbb4 dans le cœur en introduisant un transgène Erbb4 spécifique au cœur (chaîne lourde α-myosine (CMH)-Erbb4) donne des souris Erbb4^{-/- viables 10}, la génération de souris avec un P 0-GGFβ3 compliqué; Trp53^+/-;α-MHC-Erbb4; Le génotype Erbb4^-/- a été tenté.

Cependant, les accouplements n’ont pas produit de souris dans les rapports mendéliens attendus, ce qui indique que le génotype souhaité était délétère. Par conséquent, la génération de P 0-GGFβ3; Des souris Trp53^+/- avec des allèles Erbb4 ^{floxés 11} et un pilote CreER^T2 ont été tentées pour permettre la suppression d’Erbb4 dans les MPNST survenant chez ces souris. Chez ces animaux, de nombreuses cellules tumorales avec des allèles Erbb4 intacts étaient encore présentes (mosaïcisme). Le mosaïcisme observé pourrait résulter d’un apport inefficace de tamoxifène, ce qui a entraîné des différences dans l’efficacité de la recombinaison dans le tissu. La possibilité de mécanismes compensatoires spontanés pourrait contribuer davantage au mosaïcisme dans la recombinaison médiée par le tamoxifène en contournant l’exigence d’expression d’Erbb4. Il est possible que la perte de Trp53 rende les cellules tumorales sensibles à d’autres mutations spontanées « permissives » qui pourraient confondre l’interprétation des données. Comme il semblait probable que les cellules MPNST intactes d’Erbb4 masqueraient les conséquences de l’ablation d’Erbb4 dans d’autres cellules tumorales, cette approche a été abandonnée.

Ces obstacles ont conduit au développement d’une méthodologie pour ablation d’Erbb4 dans les cellules MPNST à passage très précoce à l’aide d’un adénovirus exprimant la Cre recombinase et l’eGFP. Ces cellules peuvent être séparées des cellules non infectées à l’aide de FACS, ce qui réduit considérablement le mosaïcisme du gène Erbb4 ablée. Ci-dessous, les méthodes utilisées pour y parvenir, ainsi que les méthodes utilisées pour évaluer les effets de l’ablation génique in vitro et in vivo, sont décrites. Le protocole suivant est un exemple de la façon de produire des souris porteuses de tumeurs qui produisent des tumeurs portant des allèles floxés de gènes létaux embryonnaires d’intérêt pour l’excision ex vivo avant l’évaluation de la croissance tumorale par allogreffe in vivo . Cela comprend une description des approches utilisées pour analyser l’effet que l’ablation d’Erbb4 exerce sur la prolifération des cellules tumorales, la survie et l’expression des gènes in vitro et la prolifération, la survie et l’angiogenèse dans les allogreffes orthotopiques.

Protocol

Avant d’effectuer des procédures avec des souris, toutes les procédures doivent être examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement. Le protocole décrit dans ce manuscrit a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud. Ce protocole a été exécuté par du personnel dûment formé conformément aux directives de soins aux animaux en établissement du MUSC. <p class="jove_t…

Representative Results

La figure 4 illustre un résultat typique obtenu lors de la transduction de P 0-GGFβ3 ; Trp53-/+; Cellules MPNST Erbb4fl/fl avec l’adénovirus Ad5CMV-eGFP ou l’adénovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figure 4A). Les cultures sont visualisées par microscopie à fluorescence pour identifier les cellules exprimant l’eGFP et par microscopie à contraste de phase pour déterminer le nombre total de cellules présentes d…

Discussion

Les méthodes détaillées présentées ici ont été développées à l’aide d’un modèle GEM de MPNST. Cependant, si le tissu tumoral d’intérêt peut être dispersé dans des cellules individuelles, ces méthodologies sont facilement adaptables à divers types de tumeurs survenant dans les GEM. Il est important de s’assurer que l’allèle floxé n’entraîne pas i) une diminution de la survie qui peut rendre difficile l’obtention de suffisamment de souris pour dépister les tumeurs, ou ii) une latence tumo…

Materials

Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA