悪性末梢神経鞘腫瘍細胞におけるフロックス対立遺伝子の Ex vivo アブレーションによる腫瘍形成における遺伝子機能の定義
Summary
ここでは、遺伝子操作されたマウスモデル由来腫瘍において、インビボで胚致死性である遺伝子ノックアウトを行い、そのノックアウトが腫瘍の成長、増殖、生存、遊走、浸潤、およびトランスクリプトームに及ぼす影響をインビトロおよびインビボで評価するためのプロトコルを提示する。
Abstract
ヒトがんの主要タンパク質を正確に標的とする新薬の開発は、がん治療薬を根本的に変えています。しかし、これらの薬剤を使用する前に、それらの標的タンパク質を特定のがんタイプの治療標的として検証する必要があります。この検証は、多くの場合、がんの遺伝子操作マウス(GEM)モデルで治療標的候補をコードする遺伝子をノックアウトし、これが腫瘍増殖にどのような影響を与えるかを決定することによって行われます。残念なことに、従来のノックアウトにおける胚致死性や条件付きノックアウトにおけるモザイク性などの技術的問題により、このアプローチが制限されることがよくあります。これらの制限を克服するために、GEMモデルで生成された悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)の短期培養において、目的のフロックス胚致死遺伝子を切除するアプローチが開発された。
この論文では、適切な遺伝子型を持つマウスモデルを確立し、これらの動物から短期間の腫瘍培養物を導き出し、Creリコンビナーゼと増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するアデノウイルスベクターを使用して、フロックス胚致死遺伝子をアブレーションする方法を説明します。蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いたアデノウイルスを導入した細胞の精製、および遺伝子アブレーションが細胞増殖、生存率、トランスクリプトーム、および同所性同種移植片増殖に及ぼす影響の定量化が詳述される。これらの方法論は、イン ビトロおよびインビボで 治療標的を同定および検証するための効果的かつ一般化可能なアプローチを提供する 。 これらのアプローチはまた、 インビトロ 増殖アーチファクトを減少させた低継代腫瘍由来細胞の再生可能な供給源を提供する。これにより、セクレトームによって媒介される遊走、浸潤、転移、細胞間通信などの多様な生物学的プロセスにおける標的遺伝子の生物学的役割を研究することができる。
Introduction
過去20年以前、ヒトのがんの治療は、DNAを損傷したり、DNA合成を阻害したりすることによって急速に増殖する細胞集団を広く標的とする放射線療法および化学療法剤に大きく依存していました。これらのアプローチは癌細胞の増殖を阻害したが、腸上皮細胞や毛包細胞などの正常な急速に増殖する細胞型にも有害な副作用をもたらした。より最近では、がん治療は、個々の患者の新生物の増殖にとって決定的に重要なシグナル伝達経路内のタンパク質を正確に標的とする化学療法剤を利用し始めている。一般に「プレシジョンメディシン」と呼ばれるこのアプローチは、モノクローナル抗体と小分子阻害剤のレパートリーの拡大を続ける開発につながっています。これらの薬剤は、腫瘍細胞の増殖および生存を効果的に阻害する一方で、従来の化学療法剤および放射線療法で見られる正常な細胞型に対する有害な副作用を回避する。ヒト癌の治療に使用されるモノクローナル抗体は、最も一般的には、成長因子受容体1(例えば、膜貫通受容体チロシンキナーゼの大ファミリー)および免疫応答モジュレーター2(例えば、プログラム細胞死タンパク質1、プログラム死リガンド1)などの細胞表面分子を標的とする。小分子阻害剤は、細胞内に位置する細胞表面タンパク質またはシグナル伝達タンパク質のいずれかを阻害することができる3。しかしながら、これらの新しい治療薬を効果的に採用するためには、特定の癌が候補治療薬によって標的とされている分子に依存していることを確立しなければならない。
これらの新しい治療薬はより焦点を絞った効果を有するが、それらの多くは依然として複数のタンパク質の作用を阻害する。さらに、異なる有効性および特異性を有する複数の薬剤が、特定のタンパク質を標的とするためにしばしば利用可能である。したがって、前臨床研究中には、遺伝子アブレーションなどの追加のアプローチを使用して、候補タンパク質を治療標的として検証することが賢明です。治療標的としてのタンパク質を検証するための特に有用なアプローチの1つは、目的の特定の癌タイプを発症する遺伝子操作動物モデルにおいて候補タンパク質をコードする遺伝子をアブレーションすることである。このアプローチは、ヌル変異(自然突然変異、遺伝子操作されたヌル突然変異[ノックアウト]、または遺伝子トラップによって導入されたヌル突然変異のいずれか)を有するマウスが利用可能であり、マウスが成体期まで生存可能である場合、比較的単純であり得る。残念なことに、これらの基準を満たすヌル変異を有するマウスは、典型的には、ヌル突然変異が胚性または出生後の最初の日に死をもたらすため、しばしば利用できない。このような状況では、目的の腫瘍タイプを発症しやすいマウスを、目的の遺伝子の主要セグメントがloxPサイトによって隣接しているマウス(「floxed」)に交配することができ、これにより、Creリコンビナーゼを発現する導入遺伝子を腫瘍細胞に導入することによって遺伝子をアブレーションすることができる(条件付きノックアウト)。このアプローチには、いくつかの利点があります。第1に、従来のノックアウトで死をもたらした細胞型では発現しない腫瘍では発現するCreドライバーが利用可能な場合、このアプローチは候補治療標的を潜在的に検証することができる。第2に、腫瘍細胞では候補タンパク質をコードする遺伝子をアブレーションするが、腫瘍関連線維芽細胞や免疫細胞などの他の腫瘍内要素ではアブレーションしないことで、研究者は治療標的の細胞自律効果と非細胞自律効果を区別することができる。最後に、タモキシフェン誘導性Creドライバー(CreERT2)により、研究者は腫瘍発生のさまざまな段階で目的の遺伝子を削除し、候補治療薬が有効である可能性が最も高いウィンドウを定義することができます。
残念なことに、GEMモデルで生じる腫瘍における条件付きノックアウトの使用を制限する可能性のある技術的な問題もあります。例えば、腫瘍細胞で発現され、生命に不可欠な正常細胞における遺伝子欠失を回避するCreドライバは利用できない可能性がある。過小評価されるかもしれないもう一つの問題は、CreおよびCreERT2 ドライバーがしばしばマウスのフロックス対立遺伝子を可変的にアブレーションし、GEM癌におけるヌル変異のモザイク性をもたらすことである。これが起こると、標的遺伝子がアブレーションされていない腫瘍細胞は急速に増殖し続け、アブレーションされた対立遺伝子を有する腫瘍細胞を過剰増殖させる。Creドライバラインにおけるモザイク作用は、標的とする系統における非ユビキタスなCre発現、およびCre発現4とは無関係の個々の細胞における組換えの失敗によって起こり得る。これは、細胞型に依存するCreドライバの既知の現象であり、実験計画およびデータ解釈中に考慮されるべきである。モザイクはノックアウトの効果を隠し、目的の遺伝子が腫瘍細胞の増殖および/または生存に不可欠ではなく、したがって有効な治療標的ではないと誤って結論付ける研究者を導く可能性がある。
これらの問題のいくつかは、受容体型チロシンキナーゼerbB4がMPNST細胞における潜在的な治療標的であるかどうかを決定しようとした以前の研究で遭遇した5。これらの研究では、シュワン細胞特異的ミエリンタンパク質ゼロプロモーターの制御下でノイレグリン-1(NRG1)アイソフォームグリア増殖因子-β3(GGFβ3)をコードする導入遺伝子を発現するマウス(P0-GGFβ3マウス)を用いた。P0-GGFβ3マウスは、常染色体優性腫瘍感受性症候群神経線維腫1型(NF1)6の患者に見られる神経線維腫の病因および神経線維腫-MPNST進行の過程を反復するプロセスを介してMPNSTになるために進行する複数の神経線維腫を発症する。Trp53ヌル変異を有するマウスに交配すると、P0-GGFβ3を生じる;Trp53+/-マウスは、cis-Nf1+/–に見られるようにMPNSTをde novoで発症する。Trp53+/- マウス。
これらのMPNSTは、ヒトに見られる世界保健機関(WHO)グレードIIからWHOグレードIV病変への進行を要約する7。P0-GGFβ3マウスにおいて、MPNST(58%)は三叉神経(58%)および脊髄背側神経根(68%)の既存の叢状神経線維腫内で生じる7;P 0-GGFβ3において生じるMPNSTと;Trp53+/-マウスは非常によく似た分布を有する。ヒトでは、MPNSTは坐骨神経で最も一般的に発生し、続いて上腕神経叢、脊髄神経根、迷走神経、大腿骨、中央値、仙骨神経叢、膝窩閉塞器、および後脛骨および尺骨神経が続く8。これらのGEMモデルにおけるこの腫瘍分布は、ヒトで見られるものとは多少異なる。しかしながら、P0-GGFβ3およびP0-GGFβ3において生じるMPNST;Trp53+/-マウスは組織学的にヒトMPNSTと同一であり、ヒトMPNSTに見られるのと同じ変異の多くを有し、NF1患者に見られる神経線維腫-MPNST進行の過程を再現する。P0-GGFβ3またはP0-GGFβ3の生成;Erbb4-/-であったTrp53+/-マウスは、2つのErbb4ヌル対立遺伝子を有するマウスが胚発生日10.5で子宮内で死亡し、心臓欠損に続発したため、実現不可能であった9。心臓特異的Erbb4導入遺伝子(α-ミオシン重鎖(MHC)-Erbb4)を導入することによって心臓におけるErbb4発現を救出することは、生存可能なErbb4-/-マウス10をもたらすので、複雑なP0-GGFβ3を有するマウスの生成;Trp53+/-;α-MHC-Erbb4;Erbb4-/-遺伝子型が試みられた。
しかし、交配は期待されたメンデル比でマウスを産生せず、所望の遺伝子型が有害であったことを示している。したがって、P0-GGFβ3の生成;フロックス処理Erbb4対立遺伝子11およびCreERT2ドライバーを有するTrp53+/-マウスは、これらのマウスにおいて生じるMPNSTにおけるErbb4の欠失を可能にすることを試みた。これらの動物では、無傷のErbb4対立遺伝子を有する多数の腫瘍細胞が依然として存在していた(モザイクシズム)。観察されたモザイクは、非効率的なタモキシフェン送達に起因する可能性があり、その結果、組織内の組換え効率に差が生じた。自発的な代償機構の可能性は、Erbb4発現の要件をバイパスすることによって、タモキシフェン媒介性組換えにおけるモザイクズムにさらに寄与する可能性がある。Trp53の喪失は、腫瘍細胞を、データの解釈を混乱させる可能性のある追加の自発的な「許容的」突然変異の影響を受けやすくすることは可能である。Erbb4インタクトなMPNST細胞が他の腫瘍細胞でErbb4を切除することの結果を隠す可能性が高いと思われたので、このアプローチは放棄された。
これらの障害は、CreリコンビナーゼおよびeGFPを発現するアデノウイルスを用いてMPNST細胞の非常に初期の継代においてErbb4をアブレーションするための方法論の開発につながった。これらの細胞は、アブレーションされたErbb4遺伝子のモザイク性を著しく減少させるFACSを使用して非感染細胞から分離することができる。以下、これを達成するために用いられる方法を、インビトロおよびインビボでの遺伝子アブレーションの効果を評価するために使用される方法と共に、記載する。以下のプロトコールは、in vivo同種移植片腫瘍増殖評価の前に、エキソビボ切除のために目的の胚致死遺伝子のフロックス対立遺伝子を有する腫瘍を産生する担癌マウスを製造する方法の例である。これには、Erbb4アブレーションがインビトロでの腫瘍細胞の増殖、生存、および遺伝子発現に及ぼす効果、および同所性同種移植片における増殖、生存、および血管新生を分析するために使用されるアプローチの説明が含まれる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する詳細な方法は、MPNSTのGEMモデルを使用して開発されました。しかしながら、目的の腫瘍組織を個々の細胞に分散させることができる場合、これらの方法論は、GEMSにおいて生じる様々な腫瘍タイプに容易に適応可能である。フロックス対立遺伝子が、i)腫瘍をスクリーニングするのに十分なマウスを得ることを困難にする生存率の低下、またはii)十分な担癌マウスを得ることを?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(R01 NS048353、R01 NS109655)、国立がん研究所(R01 CA122804)、国防総省(X81XWH-09-1-0086、W81XWH-11-1-0498、W81XWH-12-1-0164、W81XWH-14-1-0073、およびW81XWH-15-1-0193)、および小児腫瘍財団(2014-04-001および2015-05-007)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
|
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
- Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
- Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
- Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
- Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
- Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
- Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
- Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
- Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
- Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
- Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
- Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
- Koch, C. M., et al. A beginner’s guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
- Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
- Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
- Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
- Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
- Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
- Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
