Apoptoz, erken ve geç apoptotik biyobelirteçlerin akış sitometrik analizi ile karakterize edilebilir. Serviks kanseri hücre hattı SiHa, bir tezgah üstü akış sitometresi kullanılarak Actinomycin D ile tedaviden sonra apoptoz biyobelirteçleri için analiz edildi.
Apoptoz biyobelirteçleri, aktinomisin D ile tedavi edilen SiHa serviks kanseri hücrelerinde bir tezgah üstü akış sitometresi kullanılarak araştırıldı. Deney ve kontrol kültürlerinde apoptozun erken biyobelirteçleri (Ek V ve mitokondriyal membran potansiyeli) ve geç biyobelirteçleri (kaspaz 3 ve 7 ve DNA hasarı) ölçüldü. Kültürler, %5 CO2 ile 37 °C’de nemlendirilmiş bir inkübatörde 24 saat boyunca inkübe edildi. Hücreler daha sonra tripsin kullanılarak ayrıldı ve bir akış sitometrik hücre sayımı testi kullanılarak numaralandırıldı. Hücreler ayrıca bir Ek V testi, bir mitokondriyal elektrokimyasal transmembran potansiyel testi, bir kaspaz 3/7 testi ve bir DNA hasar testi kullanılarak apoptoz açısından analiz edildi. Bu makale, apoptoz ve geleneksel akış sitometrisine genel bir bakış sunmakta ve SiHa hücrelerinin işlenmesi ve analizi için akış sitometrik protokollerini detaylandırmaktadır. Sonuçlar pozitif, negatif ve sub-optimal deneysel verileri tanımlamaktadır. Ayrıca, bu analitik platformu kullanarak apoptozun akış sitometrik analizinin yapılmasında yorumlama ve uyarılar da tartışılmıştır. Akış sitometrik analizi, apoptoz için erken ve geç biyobelirteçlerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar.
Tip 1 programlanmış hücre ölümü1 olarak sınıflandırılan apoptoz, hücre proliferasyonu ile hücre ölümü2 arasında bir denge sağlar. Apoptoz, insan gelişimi sırasında, yaralanma sonrası ve kanser gibi hastalıkların önlenmesi için gereklidir3. İntrinsik ve ekstrinsik apoptotik hücre ölümü sinyal yolakları4 ardışık biyokimyasal ve morfolojik hücre içi değişikliklere neden olur 2,5,6. Morfolojik apoptotik özellikler mikroskopi ile tanımlanabilir ve biyokimyasal pertürbasyon, akış sitometrisi (FC) 7 dahil olmak üzere biyokimyasal testlerle analiz edilebilir.
Apoptozu tanımlamak ve ilişkili hücre içi mekanizmaları anlamak için akış sitometrik analizi son yirmi yılda filizlenmiştir8. FC, tek veya çok kanallı lazerlerden geçen bir sıvıdaki hücreleri analiz eden bilimsel bir metodolojidir (Şekil 1)9,10,11. Akışkandaki hücreler, hidrodinamik odaklama kullanılarak akış sitometresinin akışkan sistemi tarafından tek bir dosyaya odaklanır. Hücreler lazerden geçerken, ışık hücrelerden dağılır veya yayılır. Saçılan ışık ileri yönde (ileri saçılma) veya yana doğru (yan saçılma) olabilir ve sırasıyla hücre boyutu ve hücre granülerliği veya iç yapıları hakkında bilgi sağlar.
Ek olarak, floresan boyalar veya floroforlarla etiketlenmiş antikorlar gibi floresan reaktifler, belirli yüzey veya hücre içi yapıları veya molekülleri tespit eder. Lazer floroforları uyardığında, ışık belirli bir dalga boyunda yayılır. Dedektörler – genellikle fotoçarpan tüpleri – hücre örneklerinden saçılan ve yayılan ışığı ölçer. Dedektörler, ışık saçılması ve floresan emisyonu ile orantılı olarak ölçülebilir bir akım üretir. Elektronik çıktı, hücre büyüklüğüne, hücre granülerliğine ve florofor etiketlimoleküllerin 9,12,13 nispi hücre floresansına göre hücre popülasyonlarını tanımlamak için bilgisayar yazılımı tarafından dijital sinyallere dönüştürülür.
Şekil 1: Geleneksel akış sitometrisinin teknik çalışmasını ve iş akışını açıklayan şematik. Hücreler floresan reaktiflerle boyanır ve bir lazer ile incelenir. Üretilen floresan sinyalleri algılanır ve bilgisayar yazılımı ve istatistiksel programlar tarafından daha da sayısallaştırılan ve analiz edilen elektronik bir çıkışa dönüştürülür. Kısaltmalar: FSC = ileri saçılma; SSC = yan saçılma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
FC hem araştırma hem de sağlık teşhisinde kullanılır. FC’nin nekrobiyolojideki iki amacı, hücre ölümünün moleküler ve fonksiyonel özelliklerinin aydınlatılması ve hücre ölümünün çeşitli modlarının ayırt edilmesidir 14,15,16,17,18. FC uygulamaları arasında hücre sayımı, hücre popülasyonlarının sıralanması, immünofenotipleme, biyobelirteç tespiti (örneğin, apoptoz biyobelirteçleri), toksisite çalışmaları ve protein mühendisliği12 bulunmaktadır. Ek olarak, FC, hematolojik maligniteleri olan hastaların tanı ve izlenmesine yardımcı olmak için sağlık teşhisine yaygın olarak uygulanır. Enstrümantasyon, florofor tespiti ve dedektör sistemlerindeki ilerlemeler, FC uygulamalarını görüntüleme sitometrisi, kütle sitometrisi ve spektral sitometriyi daha geniş araştırma uygulamaları ile içerecek şekilde genişletmektedir12.
Apoptozun akış sitometrik analizi, hücre sağlığının değerlendirilmesinde kullanılan geleneksel tekniklere göre avantajlar sağlar. FC, apoptozu tahmin etmek için heterojen bir numunedeki birçok tek hücreyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz edebilir 3,5. FC’nin bireysel hücre bazında hücre fenotipleri hakkında nicel bilgi sağlama ve toplu analizden kaçınma yeteneği, apoptoz 8,19 analizinde kullanılan Western lekeleme, enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA’lar), florometri ve spektrofotometri tekniklerine üstün duyarlılık sunar. Ayrıca, Batı lekelerinin ve ELISA’ların hantal ve zayıf tekrarlanabilir manuel adımlarının aksine, FC analizinin göreceli kolaylığı avantajlıdır. Bu nedenle FC’nin tekrarlanabilir, doğru ve yüksek verimli analizi, kanser araştırmalarında faydalıdır20.
FC ayrıca sağlıklı ve anormal apoptotik hücre popülasyonları için hücre döngüsü parametrelerinin eşzamanlı analizine izin verir21. Apoptoz dinamik bir süreç olduğundan, farklı yöntemler değişken sonuçlar üretebilir ve hücrelerin toplandığı zaman noktasına bağlıdır22. Hücre fenotipinin çoklu parametrelerinin eşzamanlı kantitatif değerlendirmesi, küçük alt popülasyonların yüksek doğrulukla tespit edilmesine izin verir, örneğin,% 0.01’lik düşük bir frekansa sahip nadir hücre alt kümeleri tespit edilebilir23. Multi-parametrik FC analizi, apoptotik ölüm, apoptotik süreklilik boyunca çeşitli noktalardaki hücrelerle erken ve geç biyokimyasal değişikliklerin bir spektrumu boyunca meydana geldiği için özellikle yararlıdır. Örneğin, apoptotik hücrelerin FC analizinde Ek V ve propidyum iyodür kullanılarak çift boyamanın kullanılması, erken apoptotik hücrelerin, geç apoptotik hücrelerin ve ölü hücrelerin kategorize edilmesini sağlar24. Apoptozun birçok aşamada doğru tespiti, yanlış sınıflandırmayı ve yanlış negatif sonuçları önler. Bu nedenle, FC tarafından yapılan multiparametrik analiz, hücre fenotiplerini tespit etmenin genel özgüllüğünü geliştirir ve küçük popülasyonların yanlış sınıflandırılmasını önler. Ayrıca, FC tarafından hücre sıralama, sonraki analizler için yüksek saflıkta hücre popülasyonlarının izole edilmesine izin verir7.
FC’nin dezavantajı, doku analizinde zor olabilen süspansiyonda hücrelerin kullanılmasını içerir, çünkü dokunun hücrelere ayrılması hücresel fonksiyonu değiştirebilir19. Ayrıca, FC enstrüman kurulumunun, veri analizinin ve tahlil raporlarının standardizasyonunun olmaması, FC operatörlerinin performans göstermesi, verileri analiz etmesi ve raporlaması için en uygun şekilde eğitilmesi ihtiyacını vurgulayarak, sonuç19’da değişikliklere neden olabilir. Örneğin, FC’nin gerçek apoptotik kalıntıları apoptotik çekirdeklerden ayırt etme yeteneği, i) uygun edinim ayarlarını, ii) bir diploid DNA zirvesini tanımlamak için kalibrasyon boncuklarının kullanılmasını ve iii) hücreye özgü negatif ve pozitif hücre kontrollerini gerektirir3. Ayrıca, multiparametrik analiz, dedektör sayısı ile sınırlıdır ve birden fazla floresan reaktifi kullanıldığında spesifik olmayan sonuçları ve floresan emisyonunun yayılmasını önlemek için optimum kompanzasyonun yapılması gerekir25. Cihaz ve florofor teknolojisindeki ilerlemeler, parametre algılamayı 30 parametreye yükseltmiştir12.
Apoptotik hücre ölümünün tanımlanması her zaman basit değildir7 ve hassas ve spesifik biyobelirteçler dikkate alınmalıdır. Hücre Ölümü İsimlendirme Komitesi (NCCD), apoptoz26 sürecini incelemek ve ölçmek için birden fazla tahlilin kullanılmasını önermektedir. Klasik apoptotik özellikler için mikroskopi analizi26 da apoptozu doğrulamak ve yanlış pozitif sonuçlardan kaçınmak için önerilir7. Erken ve geç apoptotik olayları kapsayan dört kardinal biyokimyasal özellik şunlardır: (1) hücre zarı asimetrisinin kaybı; (2) dağılım mitokondriyal membran potansiyeli (ΔΨm); (3) kaspaz aktivasyonu; ve (4) DNA hasarı26.
Erken apoptoz sırasında, fosfatidilserin dış hücre zarı 27’ye eksternalize edilir ve fikoeritrin27,28,29 ile floresan olarak etiketlenmiş Ek V ile tespit edilebilir. Ayrıca, floresan DNA bağlayıcı boya, 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) ile çift boyama, canlı, geç apoptotik ve ölü hücreleri ayırt eder. Bu nedenle, erken apoptotik hücreler, her iki boya için de pozitif olan geç apoptotik hücrelerin aksine, Ek V için pozitif ve 7-AAD için negatif boyanır24.
İçsel apoptotik sinyaller mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔΨm) dağılmasını indükler. Bozulmuş ΔΨm, erken pro-apoptotik proteinlerin mitokondriyal membranlar arası boşluktan sitosol 27,29,30’a salınmasına neden olur. ΔΨm’deki değişim, pozitif yüklü, lipofilik boya, tetrametilrhodamin etil ester, TMRE ve 7-AAD ile çift boyama ile değerlendirilebilir. TMRE boyası, membran potansiyeli yüksek olduğunda bozulmamış mitokondrinin iç zarında birikir. Depolarize mitokondri, floresansın azaldığını gösterir. Polarize mitokondrili (sağlam mitokondriyal membran) canlı hücreler TMRE için pozitif ve 7-AAD için negatif boyanır. Depolarize mitokondrili ölü hücreler TMRE için negatif, 7-AAD31 için pozitiftir.
Kaspazlar, aktive edildiğinde apoptozu26,27 işaret eden ve yürüten bir hücre içi proteaz ailesidir. Terminal cellat kaspazları (3,6,7) geç apoptozuetkiler 29,32,33. Kaspaz-3 ve -7 aktiviteleri, bölündüğünde DNA’ya bağlanan ve floresan bir sinyal yayan floresan olarak etiketlenmiş bir substrat ile ölçülebilir. Ayrıca, hücre zarı bütünlüğünden herhangi bir ödün verilmesi, 7-AAD ile boyanarak değerlendirilebilir. Apoptotik hücreler DNA bağlayıcı boya için pozitif, ancak 7-AAD için negatiftir. Geç apoptotik ve ölü hücreler her iki boya için de pozitif lekelenir34.
Geç apoptoz, fosforile ataksi telanjiektazi mutasyona uğramış kinaz (ATM) ve histon H2A.X. Çift sarmallı DNA kırılmaları (DSB’ler) H2A.X’in fosforilasyonuna neden olan DNA hasarı 27,29,35 ile karakterizedir. X, DNA hasarını belirleyebilir. Hem ATM hem de H2A’nın negatif tespiti. X, DNA hasarı olmadığını gösterirken, her iki boyanın tespiti DNA36’da çift iplikçik kırılmalarının varlığını gösterir.
Aktinomisin D, apoptozun güçlü bir indükleyicisidir ve transkripsiyon ve translasyon olaylarını bloke etmek için DNA’ya bağlanarak hareket eder37. Bu çalışmada, SiHa hücre hattında aktinomisin D’nin indüklediği biyokimyasal apoptozun, apoptozun erken ve geç evre biyobelirteçlerini analiz ederek değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Apoptozun dört biyokimyasal biyobelirteci, hücre zarı asimetrisinin kaybı, mitokondriyal membran potansiyelindeki değişim, terminal kaspazların aktivasyonu ve DNA hasarını içeren apoptotik kaskaddaki sıralı adımları değerlendirdi.
Bu çalışmada, FC tarafından analiz edilen aktinomisin D ile tedavi edilen SiHa hücreleri, apoptoz için önemli erken ve geç biyobelirteçler ortaya koymuştur. Hücre hazırlama, numaralandırma ve boyama için alt optimal koşullar, FC’yi gerçekleştirirken üreticinin talimatlarına sıkı sıkıya bağlı kalma ihtiyacını vurgulayarak yanlış sonuçlar tespit etti.
Erken ve geç biyobelirteç tanımlaması ile yapılan bu apoptoz çalışması, apoptozun araştırılması için NCCD kılavuz1’e uygundur. Aktinomisin D ile tedavi edilen SiHa kültürleri, erken ve geç apoptotik aşamalar için pozitif biyobelirteçler göstermiştir. Ek V / PI testi ve mitokondriyal geçirgenlik testi, aktinomisin D’nin sırasıyla bir PS-çevirme paterni ve mitokondriyal membran geçişinin dağılmasını indüklediğini göstermiştir. Apoptotik hücreler mitokondriyal pertürbasyonun neden olduğu geri dönüşü olmayan noktaya ulaştığında, terminal kaspazlaraktive edilir 3,7. Bu çalışmada gözlenen terminal kaspazlar 3 ve 7’nin aktivasyonu geç evre apoptozu göstermektedir. Ayrıca, terminal kaspaz aktivasyonu, internükleozomal DNA bölünmesine ve yaygın DNA fragmantasyonuna neden olur, bu da klasik olarak jel elektroforezi28,38 tarafından gözlenen bir basamak merdiven paterni olarak bildirilmiştir.
ATM ve H2A ile nükleer hasar. X FC DNA hasar testi, DNA’da çift iplikçik kırılmaları ve toplam DNA hasarı gösterdi. Bu sonuçlar, deneysel kültürlerde klasik aşağı akış kaspazına bağlı apoptotik nükleer hasarı (karyorrhexis ve karyorrlysis) doğruladı. Çoklu akım sitometrik biyobelirteçlerin kullanılması, apoptozda sıralı çok aşamalı olayları tespit etti ve erken ve geç apoptotik aşamalarda hücre popülasyonlarını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımladı. Bu bulgular, insanlarda kanser tedavisinde aktinomisin D’nin bilinen pro-apoptotik özellikleri ile tutarlıdır 37,39,40,41 ve apoptozu araştıran FC hücre kültürü deneylerinde pozitif bir kontrol olarak aktinomisin D’nin kullanımını desteklemektedir.
Bu çalışmada hücre popülasyonlarının geçidi, apoptotikleri sağlıklı hücrelerden ayıran negatif ortam ve çözücü kontrolleri ile bilgilendirilmiştir. Alternatif olarak, pozitif ve negatif kontrol popülasyonlarının bir karışımı, hücre popülasyonu kapılarını 7,9’u ayarlamak için canlı ve apoptotik hücre popülasyonlarını tanımlamak için de kullanılabilir. Hastalıklı ve sağlıklı hücresel durumlar tanımlandıktan ve geçitlendikten sonra, şablon ayarları sonraki tüm deney ve kontrol kültürlerine uygulanabilir.
Yanlış sonuçlardan kaçınmak için FC protokolüne sıkı sıkıya bağlı kalmak esastır. Protokolün optimizasyonu sırasında, aşağıdaki problemler gözlendi: (1) düşük hücre konsantrasyonu, (2) yüksek hücre konsantrasyonu, (3) hücre kümelenmesi, (4) uzun süreli boyama ve (5) zayıf numune kullanımı. Bu sorunlar, optimize edilmiş protokol gereksinimlerine sıkı sıkıya bağlı kalınarak önlenebilir. Bu, FC’nin doğru verileri elde etmesi için analitik öncesi ve analitik adımların çok önemli doğasını vurgulamaktadır. Hücre hazırlığı sırasında, tripsinizasyon, pipetleme, santrifüjleme ve seyreltmeler dikkatle yapılmalıdır. Aşırı tripsinizasyon ve kuvvetli pipetleme, sırasıyla hücrelerin kimyasal ve mekanik olarak kesilmesine neden olabilir. Uzun süreli ve yüksek hızlı santrifüjleme, hücre parçalanmasına ve yüksek hücresel enkaz sayımlarına neden olabilir. Hücre olaylarının yanlış edinilmesini en aza indirmek için optimal hücre konsantrasyonu gereklidir. Bu nedenle, optimal hücre konsantrasyonu elde etmek için birincil hücre süspansiyonları seyreltilmelidir.
Ayrıca, numuneleri işlerken, hücre kümelenmesini ve hücre parçalanmasını önlemek ve analiz sırasında hücrelerin süspansiyonda kalmasını sağlamak için özen gösterilmelidir. Hücre kümelenmesini önlemek için numune işleme, tek laminer hücre akışına izin verir, cihazın kılcal borusunun mekanik tıkanmasını önler ve sahte büyük hücre boyutu indekslerini engeller. Diğer bir uyarı, foto-oksidasyonu önlemek için kültürleri ışığa karşı korumak ve yanlış negatif sonuçları önlemek için tahlillerde floroforların söndürülmesidir. Hücrelerin boyama adımında ve sonraki işlem adımlarında minimum ışığa maruz kalmayı sağlamak için özen gösterilmelidir. Ayrıca, uzun süreli immün boyama süreleri, proteinler spesifik olarak boyanmadığı için yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle, üretici tarafından reçete edilen inkübasyon boyama sürelerine bağlılık önemlidir.
Özetle, FC apoptozu doğru bir şekilde tespit edebilir ve hücre kültüründe erken ve geç apoptoz biyobelirteçleri arasında ayrım yapabilir. Ek olarak, teknolojideki ilerlemeler, uzman olmayan bilim adamlarının hücre sağlığını ve karmaşık hücre içi sinyal yollarını incelemeleri için tezgah üstü akış sitometrelerinin üretilmesine yol açmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Çalışma, Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) ve Güney Afrika Tıbbi Araştırma Konseyi (SAMRC) tarafından finansal olarak desteklendi. Guava Muse Hücre Analizörü’nü satın aldığı için Ulusal Sağlık Laboratuvarı Servisi’ne (NHLS) teşekkür ederiz. Bu yayındaki tüm rakamlar Biorender.com ile oluşturulmuştur.
6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |