Apoptose kan worden gekenmerkt door flowcytometrische analyse van vroege en late apoptotische biomarkers. De cervicale kankercellijn, SiHa, werd geanalyseerd op apoptosebiomarkers na behandeling met Actinomycine D met behulp van een benchtop flowcytometer.
Apoptose biomarkers werden onderzocht in actinomycine D-behandelde SiHa baarmoederhalskankercellen met behulp van een benchtop flow cytometer. Vroege biomarkers (Annexine V en mitochondriaal membraanpotentiaal) en late biomarkers (caspasen 3 en 7, en DNA-schade) van apoptose werden gemeten in experimentele en controleculturen. Culturen werden gedurende 24 uur geïncubeerd in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. De cellen werden vervolgens losgemaakt met behulp van trypsine en geïnventariseerd met behulp van een flowcytometrische celtellingstest. Cellen werden verder geanalyseerd op apoptose met behulp van een Annexin V-test, een mitochondriale elektrochemische transmembraanpotentiaaltest, een caspase 3/7-test en een DNA-schadetest. Dit artikel geeft een overzicht van apoptose en traditionele flowcytometrie en werkt flowcytometrische protocollen uit voor het verwerken en analyseren van SiHa-cellen. De resultaten beschrijven positieve, negatieve en suboptimale experimentele gegevens. Ook worden interpretatie en kanttekeningen besproken bij het uitvoeren van flowcytometrische analyse van apoptose met behulp van dit analytische platform. Flowcytometrische analyse biedt een nauwkeurige meting van vroege en late biomarkers voor apoptose.
Apoptose, geclassificeerd als type 1 geprogrammeerde celdood1, zorgt voor een evenwicht tussen celproliferatie en celdood2. Apoptose is essentieel tijdens de menselijke ontwikkeling, na letsel en voor de preventie van ziekten zoals kanker3. Intrinsieke en extrinsieke apoptotische celdood signaleringsroutes4 veroorzaken sequentiële biochemische en morfologische intracellulaire veranderingen 2,5,6. Morfologische apoptotische kenmerken kunnen worden geïdentificeerd door microscopie en de biochemische verstoring kan worden geanalyseerd door biochemische assays, waaronder flowcytometrie (FC)7.
Flowcytometrische analyse om apoptose te identificeren en de bijbehorende intracellulaire mechanismen te begrijpen, is de afgelopen twee decennia gegroeid8. FC is een wetenschappelijke methodologie die cellen analyseert in een vloeistof die door een- of meerkanaalslasers gaat (figuur 1)9,10,11. De cellen in de vloeistof worden in één bestand geconcentreerd door het fluidics-systeem van de flowcytometer met behulp van hydrodynamische focus. Terwijl cellen door de laser gaan, wordt licht verstrooid of uitgezonden door de cellen. Het verstrooide licht kan zich in de voorwaartse richting (voorwaartse verstrooiing) of naar de zijkant (zijverstrooiing) bevinden en geeft informatie over respectievelijk de celgrootte en celgranulariteit of interne structuren.
Bovendien detecteren fluorescerende reagentia, zoals fluorescerende kleurstoffen of antilichamen gelabeld met fluoroforen, specifieke oppervlakte- of intracellulaire structuren of moleculen. Wanneer de laser de fluoroforen prikkelt, wordt licht uitgezonden op een specifieke golflengte. Detectoren – meestal fotomultiplicatorbuizen – kwantificeren het verstrooide en uitgezonden licht van celmonsters. De detectoren produceren een kwantificeerbare stroom die evenredig is met de lichtverstrooiing en fluorescentie-emissie. De elektronische uitvoer wordt door computersoftware omgezet in digitale signalen om celpopulaties te identificeren op basis van celgrootte, celgranulariteit en de relatieve celfluorescentie van fluorofoor-gelabelde moleculen 9,12,13.
Figuur 1: Schematische beschrijving van de technische werking en workflow van traditionele flowcytometrie. Cellen worden gekleurd met fluorescerende reagentia en onderzocht door een laser. De gegenereerde fluorescentiesignalen worden gedetecteerd en omgezet in een elektronische uitgang, die verder wordt gedigitaliseerd en geanalyseerd door computersoftware en statistische programma’s. Afkortingen: FSC = forward scatter; SSC = zijverstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FC wordt gebruikt in zowel onderzoek als gezondheidsdiagnostiek. De twee doelen van FC in de necrobiologie zijn de opheldering van moleculaire en functionele eigenschappen van celdood en de discriminatie van verschillende vormen van celdood 14,15,16,17,18. FC-toepassingen omvatten celinventarisatie, sortering van celpopulaties, immunofenotypering, biomarkerdetectie (bijv. Apoptose-biomarkers), toxiciteitsstudies en eiwittechnologie12. Bovendien wordt FC vaak toegepast op gezondheidsdiagnostiek om te helpen bij de diagnose en monitoring van patiënten met hematologische maligniteiten. Vooruitgang in instrumentatie, fluorofoordetectie en detectorsystemen breiden FC-toepassingen uit met beeldvormingscytometrie, massacytometrie en spectrale cytometrie met bredere onderzoekstoepassingen12.
De flowcytometrische analyse van apoptose biedt voordelen ten opzichte van traditionele technieken die worden gebruikt bij het beoordelen van de gezondheid van cellen. FC kan veel afzonderlijke cellen in een heterogeen monster snel en reproduceerbaar analyseren om apoptose 3,5 te schatten. Het vermogen van FC om kwantitatieve informatie te verstrekken over celfenotypes op individuele celbasis en bulkanalyse te vermijden, biedt een superieure gevoeligheid voor Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA’s), fluorometrie en spectrofotometrietechnieken die worden gebruikt bij de analyse van apoptose 8,19. Bovendien is het relatieve gemak van FC-analyse in tegenstelling tot de omslachtige en slecht reproduceerbare handmatige stappen van Western blots en ELISA’s voordelig. De reproduceerbare, nauwkeurige en high-throughput analyse van FC is daarom gunstig in kankeronderzoek20.
FC maakt ook de gelijktijdige analyse van celcyclusparameters voor gezonde en abnormale apoptotische celpopulatiesmogelijk 21. Omdat apoptose een dynamisch proces is, kunnen verschillende methoden variabele resultaten opleveren en zijn ze afhankelijk van het tijdstip waarop de cellen worden geoogst22. De gelijktijdige kwantitatieve beoordeling van meerdere parameters van het celfenotype maakt de detectie van kleine subpopulaties met hoge nauwkeurigheid mogelijk, bijvoorbeeld zeldzame celsubsets met een lage frequentie van 0,01% kunnen worden gedetecteerd23. Multiparametrische FC-analyse is vooral nuttig omdat apoptotische dood optreedt langs een spectrum van vroege en late biochemische veranderingen met cellen op verschillende punten langs het apoptotische continuüm. Het gebruik van dubbele kleuring met behulp van Annexine V en propidiumjodide in FC-analyse van apoptotische cellen maakt bijvoorbeeld de categorisering van vroege apoptotische cellen, late apoptotische cellen en dode cellenmogelijk 24. De nauwkeurige detectie van apoptose in meerdere stadia voorkomt verkeerde classificatie en vals-negatieve resultaten. Multiparametrische analyse door FC verbetert dus de algemene specificiteit van het detecteren van celfenotypen en voorkomt de verkeerde classificatie van kleine populaties. Bovendien maakt celsortering op FC de isolatie van celpopulaties met een hoge zuiverheid mogelijk voor latere analyse7.
Het nadeel van FC omvat het gebruik van cellen in suspensie, wat een uitdaging kan zijn bij weefselanalyse, omdat desaggregatie van weefsel in cellen de cellulaire functie kan veranderen19. Bovendien kan het gebrek aan standaardisatie van FC-instrumentinstellingen, gegevensanalyse en testrapporten variatie in resultatenveroorzaken 19, wat de noodzaak benadrukt om FC-operators optimaal te trainen om te presteren en gegevens te analyseren en te rapporteren. Het vermogen van FC om echt apoptotisch puin van apoptotische kernen te onderscheiden, vereist bijvoorbeeld i) de juiste acquisitie-instellingen, ii) het gebruik van kalibratieparels om een diploïde DNA-piek te identificeren, en iii) negatieve en positieve celcontroles die celspecifiek zijn3. Bovendien wordt multiparametrische analyse beperkt door het aantal detectoren en moet optimale compensatie worden uitgevoerd om niet-specifieke resultaten en overloop van fluorescerende emissie bij gebruik van meerdere fluorescerende reagentiate voorkomen 25. Vooruitgang in instrument- en fluorofoortechnologie heeft de parameterdetectie verbeterd tot 30 parameters12.
De identificatie van apoptotische celdood is niet altijd eenvoudig7, en gevoelige en specifieke biomarkers moeten worden overwogen. Het Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) beveelt aan dat meer dan één test wordt gebruikt om het proces van apoptose te bestuderen en te kwantificeren26. Microscopie-analyse voor klassieke apoptotische kenmerken26 wordt ook aanbevolen om apoptose te bevestigen en vals-positieve resultaten te voorkomen7. Vier kardinale biochemische kenmerken die vroege en late apoptotische gebeurtenissen omvatten, zijn (1) verlies van celmembraanasymmetrie; (2) dissipatie mitochondriaal membraanpotentiaal (ΔΨm); (3) caspase-activering; en (4) DNA-schade26.
Tijdens vroege apoptose wordt fosfatidylserine geëxternaliseerd naar het buitenste celmembraan 27 en kan worden gedetecteerd door Annexine V fluorescerend gelabeld met fycoerythrin27,28,29. Bovendien onderscheidt dubbele kleuring met de fluorescerende DNA-bindende kleurstof, 7-aminoactinomycine D (7-AAD), levende, laat-apoptotische en dode cellen. Daarom kleuren vroege apoptotische cellen positief voor Annexine V en negatief voor 7-AAD, in tegenstelling tot laat-apoptotische cellen, die positief kleuren voor beide kleurstoffen24.
Intrinsieke apoptotische signalen induceren dissipatie van de mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm). Het verstoorde ΔΨm veroorzaakt de afgifte van vroege pro-apoptotische eiwitten uit de mitochondriale intermembraanruimte in het cytosol27,29,30. Verandering in ΔΨm kan worden beoordeeld door dubbele kleuring met de positief geladen, lipofiele kleurstof, tetramethylrhodamine ethylester, TMRE en 7-AAD. De TMRE-kleurstof hoopt zich op in het binnenmembraan van intacte mitochondriën wanneer het membraanpotentiaal hoog is. Gedepolariseerde mitochondriën vertonen verminderde fluorescentie. Levende cellen met gepolariseerde mitochondriën (intact mitochondriaal membraan) kleuren positief voor TMRE en negatief voor 7-AAD. Dode cellen met gedepolariseerde mitochondriën kleuren negatief voor TMRE en positief voor 7-AAD31.
De caspasen zijn een familie van intracellulaire proteasen die, wanneer geactiveerd, apoptose26,27 signaleren en uitvoeren. De terminale beul caspasen (3,6,7) effect late apoptose 29,32,33. Caspase-3- en -7-activiteiten kunnen worden gemeten door een fluorescerend gelabeld substraat, dat, wanneer het wordt gesplitst, zich bindt aan DNA en een fluorescerend signaal uitzendt. Bovendien kan elk compromis aan de integriteit van het celmembraan worden beoordeeld door kleuring met 7-AAD. Apoptotische cellen kleuren positief voor de DNA-bindende kleurstof, maar negatief voor 7-AAD. Laat-apoptotische en dode cellen kleuren positief voor beide kleurstoffen34.
Late apoptose wordt gekenmerkt door DNA-schade27,29,35, die kan worden geëvalueerd door gefosforyleerde ataxiatelangiectasia gemuteerd kinase (ATM) en histon H2A.X. Dubbelstrengs DNA-breuken (DSB’s) veroorzaken fosforylering van H2A.X. Fluorescerend gelabelde antilichamen tegen ATM en H2A. X kan DNA-schade vaststellen. Negatieve detectie van zowel ATM als H2A. X duidt niet op DNA-schade, terwijl detectie van beide kleurstoffen wijst op de aanwezigheid van dubbelstrengsbreuken in het DNA36.
Actinomycine D is een krachtige inductor van apoptose en werkt door binding aan DNA om transcriptie- en translatiegebeurtenissen te blokkeren37. Deze studie was gericht op het beoordelen van biochemische apoptose geïnduceerd door actinomycine D in de SiHa-cellijn door biomarkers van apoptose in een vroeg en laat stadium te analyseren. Vier biochemische biomarkers van apoptose beoordeelden de sequentiële stappen in de apoptotische cascade, waaronder verlies van celmembraanasymmetrie, verandering in mitochondriaal membraanpotentiaal, activering van terminale caspasen en DNA-schade.
In deze studie onthulden actinomycine D-behandelde SiHa-cellen geanalyseerd door FC significante vroege en late biomarkers voor apoptose. Suboptimale omstandigheden voor celvoorbereiding, inventarisatie en kleuring identificeerden onnauwkeurige resultaten, waarbij de nadruk werd gelegd op de noodzaak van nauwe naleving van de instructies van de fabrikant bij het uitvoeren van FC.
Deze studie van apoptose door vroege en late biomarkeridentificatie voldoet aan de NCCD-richtlijnen1 voor het onderzoeken van apoptose. Actinomycine D-behandelde SiHa-culturen toonden positieve biomarkers voor vroege en late apoptotische stadia. De Annexin V/PI-test en de mitochondriale permeabiliteitstest toonden aan dat actinomycine D respectievelijk een PS-flip-patroon en dissipatie van de mitochondriale membraanovergang induceerde. Zodra apoptotische cellen het point of no return bereiken, geïnduceerd door mitochondriale verstoring, worden de terminale caspasen geactiveerd 3,7. De activering van de terminale caspasen 3 en 7 die in deze studie zijn waargenomen, duidt op apoptose in een laat stadium. Bovendien veroorzaakt terminale caspase-activering internucleosomale DNA-splitsing en uitgebreide DNA-fragmentatie, die klassiek is gerapporteerd als een trapladderpatroon waargenomen door gel-elektroforese28,38.
De nucleaire schade met de ATM en H2A. X FC DNA-schadetest toonde dubbelstrengsbreuken in DNA en totale DNA-schade. Deze resultaten bevestigden klassieke downstream caspase-geïnduceerde apoptotische nucleaire schade (karyoorrhexis en karyorrlyse) in experimentele culturen. Het gebruik van meerdere flowcytometrische biomarkers detecteerde dus de sequentiële meertrapsgebeurtenissen in apoptose en nauwkeurig en reproduceerbaar geïdentificeerde celpopulaties in vroege en late apoptotische stadia. Deze bevindingen komen overeen met de bekende pro-apoptotische kenmerken van actinomycine D bij de behandeling van kanker bij mensen 37,39,40,41 en ondersteunen verder het gebruik van actinomycine D als een positieve controle in FC-celkweekexperimenten die apoptose onderzoeken.
De gating van celpopulaties in deze studie werd geïnformeerd door negatieve medium- en oplosmiddelcontroles, die apoptotische van gezonde cellen scheidden. Als alternatief kan een mengsel van populaties van positieve en negatieve controles ook worden gebruikt om levende en apoptotische celpopulaties te definiëren om celpopulatiepoorten 7,9 in te stellen. Zodra zieke en gezonde cellulaire toestanden zijn gedefinieerd en afgeschermd, kunnen de sjablooninstellingen worden toegepast op alle volgende experimentele en controleculturen.
Strikte naleving van het FC-protocol is essentieel om valse resultaten te voorkomen. Tijdens de optimalisatie van het protocol werden de volgende problemen waargenomen: (1) lage celconcentratie, (2) hoge celconcentratie, (3) celklontering, (4) langdurige kleuring en (5) slechte monsterbehandeling. Deze problemen kunnen worden voorkomen door strikte naleving van geoptimaliseerde protocolvereisten. Dit benadrukt de cruciale aard van pre-analytische en analytische stappen voor FC om nauwkeurige gegevens te verkrijgen. Tijdens de celvoorbereiding moeten trypsinisatie, pipetteren, centrifugeren en verdunningen met zorg worden uitgevoerd. Over-trypsinisatie en krachtig pipetteren kunnen resulteren in respectievelijk chemische en mechanische afschuiving van cellen. Langdurige en snelle centrifugatie kan leiden tot celafbraak en hoge cellulaire puintellingen. Optimale celconcentratie is vereist om de onjuiste verwerving van celgebeurtenissen te minimaliseren. Daarom moeten primaire celsuspensies worden verdund om een optimale celconcentratie te verkrijgen.
Bovendien moet er bij het hanteren van monsters op worden gelet dat celklontering en celfragmentatie worden voorkomen en dat cellen tijdens de analyse in suspensie blijven. Monsterbehandeling om celklontering te voorkomen, maakt een enkele laminaire celstroom mogelijk, voorkomt mechanische blokkering van de capillaire buizen van het instrument en beteugelt valse grote celgrootte-indexen. Een ander voorbehoud is het beschermen van culturen tegen licht om foto-oxidatie te voorkomen en het blussen van de fluoroforen in de testen om vals-negatieve resultaten te voorkomen. Er moet voor worden gezorgd dat er een minimale blootstelling aan licht is bij de kleuringsstap van de cellen en de daaropvolgende verwerkingsstappen. Bovendien kunnen langdurige immunostainingtijden resulteren in vals-positieve resultaten omdat eiwitten niet-specifiek gekleurd zijn. Daarom is het belangrijk om zich te houden aan door de fabrikant voorgeschreven incubatiekleuringsperioden.
Samenvattend kan FC apoptose nauwkeurig detecteren en onderscheid maken tussen vroege en late apoptosebiomarkers in celkweek. Bovendien heeft technologische vooruitgang geleid tot de productie van benchtop flowcytometers voor niet-deskundige wetenschappers om celgezondheid en complexe intracellulaire signaleringsroutes te bestuderen.
The authors have nothing to disclose.
De studie werd financieel ondersteund door de National Research Foundation (NRF) en de South African Medical Research Council (SAMRC). We willen graag de National Health Laboratory Service (NHLS) bedanken voor de aankoop van de Guava Muse Cell Analyzer. Alle figuren in deze publicatie zijn gemaakt met Biorender.com.
6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |