La apoptosis se puede caracterizar mediante el análisis citométrico de flujo de biomarcadores apoptóticos tempranos y tardíos. La línea celular de cáncer cervical, SiHa, se analizó en busca de biomarcadores de apoptosis después del tratamiento con actinomicina D utilizando un citómetro de flujo de sobremesa.
Los biomarcadores de apoptosis se investigaron en células de cáncer de cuello uterino SiHa tratadas con actinomicina D utilizando un citómetro de flujo de sobremesa. Los biomarcadores tempranos (anexina V y potencial de membrana mitocondrial) y los biomarcadores tardíos (caspasas 3 y 7, y daño al ADN) de la apoptosis se midieron en cultivos experimentales y control. Los cultivos se incubaron durante 24 horas en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2. Luego, las células se separaron usando tripsina y se enumeraron mediante un ensayo de recuento de células por citometría de flujo. Las células se analizaron más a fondo para la apoptosis utilizando un ensayo de anexina V, un ensayo de potencial transmembrana electroquímico mitocondrial, un ensayo de caspasa 3/7 y un ensayo de daño en el ADN. Este artículo proporciona una visión general de la apoptosis y la citometría de flujo tradicional, y elabora protocolos citométricos de flujo para procesar y analizar células SiHa. Los resultados describen datos experimentales positivos, negativos y subóptimos. También se discuten la interpretación y las advertencias en la realización del análisis citométrico de flujo de la apoptosis utilizando esta plataforma analítica. El análisis citométrico de flujo proporciona una medición precisa de los biomarcadores tempranos y tardíos para la apoptosis.
La apoptosis, clasificada como muerte celular programada tipo 11, asegura un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular2. La apoptosis es esencial durante el desarrollo humano, después de la lesión y para la prevención de enfermedades como el cáncer3. Las vías de señalización de muerte celular apoptótica intrínseca y extrínseca4 causan cambios intracelulares bioquímicos y morfológicos secuenciales 2,5,6. Las características apoptóticas morfológicas pueden ser identificadas por microscopía, y la perturbación bioquímica puede ser analizada por ensayos bioquímicos, incluyendo citometría de flujo (FC)7.
El análisis citométrico de flujo para identificar la apoptosis y comprender los mecanismos intracelulares asociados ha florecido en las últimas dos décadas8. La FC es una metodología científica que analiza células en un fluido que pasa a través de láseres monocanal o multicanal (Figura 1)9,10,11. Las células en el fluido se enfocan en una sola fila por el sistema fluídico del citómetro de flujo utilizando enfoque hidrodinámico. A medida que las células pasan a través del láser, la luz se dispersa o se emite desde las células. La luz dispersa puede estar en la dirección hacia adelante (dispersión hacia adelante) o hacia el lado (dispersión lateral) y proporciona información sobre el tamaño de la celda y la granularidad de la celda o las estructuras internas, respectivamente.
Además, los reactivos fluorescentes, como los colorantes fluorescentes o los anticuerpos marcados con fluoróforos, detectan estructuras o moléculas específicas de superficie o intracelulares. Cuando el láser excita los fluoróforos, la luz se emite a una longitud de onda específica. Los detectores, comúnmente tubos fotomultiplicadores, cuantifican la luz dispersa y emitida de las muestras celulares. Los detectores producen una corriente cuantificable que es proporcional a la dispersión de luz y la emisión de fluorescencia. La salida electrónica se convierte en señales digitales mediante software informático para identificar poblaciones celulares basadas en el tamaño celular, la granularidad celular y la fluorescencia celular relativa de las moléculas marcadas con fluoróforos 9,12,13.
Figura 1: Esquema que describe el funcionamiento técnico y el flujo de trabajo de la citometría de flujo tradicional. Las células se tiñen con reactivos fluorescentes y se sondean con un láser. Las señales de fluorescencia generadas se detectan y se convierten en una salida electrónica, que se digitaliza y analiza mediante software informático y programas estadísticos. Abreviaturas: FSC = dispersión hacia adelante; SSC = dispersión lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La FC se utiliza tanto en investigación como en diagnósticos de salud. Los dos objetivos de la CF en necrobiología son la elucidación de las propiedades moleculares y funcionales de la muerte celular y la discriminación de varios modos de muerte celular 14,15,16,17,18. Las aplicaciones de FC incluyen enumeración celular, clasificación de poblaciones celulares, inmunofenotipado, detección de biomarcadores (por ejemplo, biomarcadores de apoptosis), estudios de toxicidad e ingeniería de proteínas12. Además, la CF se aplica comúnmente al diagnóstico de salud para ayudar con el diagnóstico y monitoreo de pacientes con neoplasias hematológicas. Los avances en instrumentación, detección de fluoróforos y sistemas detectores están ampliando las aplicaciones de FC para incluir citometría de imágenes, citometría de masas y citometría espectral con aplicaciones de investigación más amplias12.
El análisis citométrico de flujo de la apoptosis proporciona ventajas sobre las técnicas tradicionales utilizadas en la evaluación de la salud celular. FC puede analizar muchas células individuales en una muestra heterogénea de forma rápida y reproducible para estimar la apoptosis 3,5. La capacidad de la CF para proporcionar información cuantitativa sobre fenotipos celulares sobre una base celular individual, y evitar el análisis a granel, ofrece una sensibilidad superior a Western blotting, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), fluorometría y técnicas de espectrofotometría utilizadas en el análisis de la apoptosis 8,19. Además, la relativa facilidad del análisis de CF en contraste con los pasos manuales engorrosos y poco reproducibles de Western blots y ELISA es ventajosa. Por lo tanto, el análisis reproducible, preciso y de alto rendimiento de la CF es beneficioso en la investigación del cáncer20.
La FC también permite el análisis simultáneo de parámetros del ciclo celular para poblaciones de células apoptóticas sanas y anormales21. Como la apoptosis es un proceso dinámico, diferentes métodos pueden producir resultados variables y dependen del momento en que las células son cosechadas22. La evaluación cuantitativa simultánea de múltiples parámetros del fenotipo celular permite la detección de subpoblaciones menores con alta precisión, por ejemplo, se pueden detectar subconjuntos celulares raros con una baja frecuencia de 0,01%23. El análisis multiparamétrico de FC es especialmente útil ya que la muerte apoptótica ocurre a lo largo de un espectro de cambios bioquímicos tempranos y tardíos con células en varios puntos a lo largo del continuo apoptótico. Por ejemplo, el uso de tinción dual utilizando anexina V y yoduro de propidio en el análisis de FC de células apoptóticas permite la categorización de células apoptóticas tempranas, células apoptóticas tardías y células muertas24. La detección precisa de la apoptosis en múltiples etapas evita la clasificación errónea y los resultados falsos negativos. Por lo tanto, el análisis multiparamétrico por FC mejora la especificidad general de la detección de fenotipos celulares y evita la clasificación errónea de poblaciones menores. Además, la clasificación celular por FC permite el aislamiento de poblaciones celulares con alta pureza para su posterior análisis7.
La desventaja de la CF incluye el uso de células en suspensión, lo que puede ser un desafío en el análisis de tejidos, ya que la desagregación del tejido en células puede alterar la función celular19. Además, la falta de estandarización de la configuración del instrumento FC, el análisis de datos y los informes de ensayo puede causar variación en los resultados19, enfatizando la necesidad de capacitar de manera óptima a los operadores de FC para realizar, analizar y reportar datos. Por ejemplo, la capacidad de FC para discriminar verdaderos desechos apoptóticos de núcleos apoptóticos requiere i) configuraciones de adquisición adecuadas, ii) el uso de perlas de calibración para identificar un pico de ADN diploide, y iii) controles celulares negativos y positivos que son específicos de la célula3. Además, el análisis multiparamétrico está limitado por el número de detectores, y es necesario realizar una compensación óptima para evitar resultados no específicos y el desbordamiento de la emisión fluorescente cuando se utilizan múltiples reactivos fluorescentes25. Los avances en la tecnología de instrumentos y fluoróforos han mejorado la detección de parámetros a 30 parámetros12.
La identificación de la muerte celular apoptótica no siempre es sencilla7, y se deben considerar biomarcadores sensibles y específicos. El Comité de Nomenclatura sobre Muerte Celular (NCCD) recomienda que se utilice más de un ensayo para estudiar y cuantificar el proceso de apoptosis26. El análisis microscópico para las características apoptóticas clásicas26 también se recomienda para confirmar la apoptosis y evitar resultados falsos positivos7. Cuatro características bioquímicas cardinales que abarcan eventos apoptóticos tempranos y tardíos son (1) pérdida de asimetría de la membrana celular; (2) disipación del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm); (3) activación de caspasas; y (4) daño en el ADN26.
Durante la apoptosis temprana, la fosfatidilserina se exterioriza a la membrana celular externa 27 y puede ser detectada por la anexina V marcada fluorescentemente con ficoeritrina27,28,29. Además, la tinción dual con el colorante fluorescente de unión al ADN, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), distingue células vivas, apoptóticas tardías y muertas. Por lo tanto, las células apoptóticas tempranas se tiñen positivas para la anexina V y negativas para la 7-AAD, en contraste con las células apoptóticas tardías, que se tiñen positivas para ambos colorantes24.
Las señales apoptóticas intrínsecas inducen la disipación del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). El ΔΨm interrumpido provoca la liberación de proteínas proapoptóticas tempranas desde el espacio intermembrana mitocondrial hacia el citosol27,29,30. El cambio en ΔΨm se puede evaluar mediante tinción dual con el colorante lipofílico cargado positivamente, éster etílico de tetrametilrodamina, TMRE y 7-AAD. El colorante TMRE se acumula dentro de la membrana interna de las mitocondrias intactas cuando el potencial de membrana es alto. Las mitocondrias despolarizadas demuestran una disminución de la fluorescencia. Las células vivas con mitocondrias polarizadas (membrana mitocondrial intacta) se tiñen positivas para TMRE y negativas para 7-AAD. Las células muertas con mitocondrias despolarizadas se tiñen negativas para TMRE y positivas para 7-AAD31.
Las caspasas son una familia de proteasas intracelulares que, cuando se activan, señalan y ejecutan la apoptosis26,27. Las caspasas del verdugo terminal (3,6,7) efecto apoptosis tardía 29,32,33. Las actividades de las caspasa-3 y -7 se pueden medir mediante un sustrato marcado con fluorescencia, que, cuando se escinde, se une al ADN y emite una señal fluorescente. Además, cualquier compromiso con la integridad de la membrana celular se puede evaluar mediante tinción con 7-AAD. Las células apoptóticas se tiñen positivas para el tinte de unión al ADN pero negativas para 7-AAD. Las células apoptóticas tardías y muertas se tiñen positivas para ambos colorantes34.
La apoptosis tardía se caracteriza por daño en el ADN27,29,35, que puede evaluarse mediante la quinasa mutada fosforilada de ataxiatelangiectasia (ATM) y la histona H2A.X. Las roturas de ADN bicatenario (DSB) causan fosforilación de H2A.X. Anticuerpos marcados con fluorescencia contra ATM y H2A. X puede determinar el daño del ADN. Detección negativa tanto de ATM como de H2A. X indica que no hay daño en el ADN, mientras que la detección de ambos colorantes indica la presencia de roturas de doble cadena en el ADN36.
La actinomicina D es un potente inductor de la apoptosis y actúa uniéndose al ADN para bloquear los eventos de transcripción y traducción37. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la apoptosis bioquímica inducida por actinomicina D en la línea celular SiHa mediante el análisis de biomarcadores de apoptosis en etapa temprana y tardía. Cuatro biomarcadores bioquímicos de apoptosis evaluaron los pasos secuenciales en la cascada apoptótica que incluyeron la pérdida de asimetría de la membrana celular, el cambio en el potencial de la membrana mitocondrial, la activación de caspasas terminales y el daño al ADN.
En este estudio, las células SiHa tratadas con actinomicina D analizadas por FC revelaron biomarcadores tempranos y tardíos significativos para la apoptosis. Las condiciones subóptimas para la preparación, enumeración y tinción de células identificaron resultados inexactos, enfatizando la necesidad de un estricto cumplimiento de las instrucciones del fabricante al realizar FC.
Este estudio de la apoptosis por identificación temprana y tardía de biomarcadores se ajusta a las directrices NCCD1 para investigar la apoptosis. Los cultivos de SiHa tratados con actinomicina D demostraron biomarcadores positivos para las etapas apoptóticas tempranas y tardías. El ensayo Annexin V/PI y el ensayo de permeabilidad mitocondrial mostraron que la actinomicina D indujo un patrón PS-flip y la disipación de la transición de la membrana mitocondrial, respectivamente. Una vez que las células apoptóticas alcanzan el punto de no retorno inducido por la perturbación mitocondrial, las caspasas terminales se activan 3,7. La activación de las caspasas terminales 3 y 7 observadas en este estudio indica apoptosis en etapa tardía. Además, la activación de la caspasa terminal causa escisión internucleosómica del ADN y fragmentación extensa del ADN, que clásicamente ha sido reportada como un patrón de escalera escalonada observado por electroforesis en gel28,38.
El daño nuclear con el ATM y H2A. El ensayo de daño de ADN de X FC mostró roturas de doble cadena en el ADN y daño total del ADN. Estos resultados confirmaron el daño nuclear apoptótico clásico inducido por caspasa aguas abajo (cariorrexis y cariorrisis) en cultivos experimentales. El uso de biomarcadores citométricos de flujo múltiple detectó así los eventos secuenciales de múltiples etapas en la apoptosis e identificó de manera precisa y reproducible las poblaciones celulares en las etapas apoptóticas tempranas y tardías. Estos hallazgos son consistentes con las características pro-apoptóticas conocidas de la actinomicina D en el tratamiento del cáncer en humanos 37,39,40,41 y apoyan aún más el uso de la actinomicina D como un control positivo en experimentos de cultivo celular de FC que investigan la apoptosis.
La activación de las poblaciones celulares en este estudio fue informada por controles negativos de medio y solvente, que separaron las células apoptóticas de las sanas. Alternativamente, también se puede usar una mezcla de poblaciones de controles positivos y negativos para definir poblaciones de células vivas y apoptóticas para establecer puertas de población celular 7,9. Una vez que los estados celulares enfermos y saludables están definidos y cerrados, la configuración de la plantilla se puede aplicar a todas las culturas experimentales y de control posteriores.
El estricto cumplimiento del protocolo FC es esencial para evitar resultados falsos. Durante la optimización del protocolo, se observaron los siguientes problemas: (1) baja concentración celular, (2) alta concentración celular, (3) aglutinación celular, (4) tinción prolongada y (5) manejo deficiente de la muestra. Estos problemas se pueden prevenir mediante el estricto cumplimiento de los requisitos de protocolo optimizados. Esto enfatiza la naturaleza crucial de los pasos preanalíticos y analíticos para que CF obtenga datos precisos. Durante la preparación celular, la tripsinización, el pipeteo, la centrifugación y las diluciones deben realizarse con cuidado. La tripsinización excesiva y el pipeteo vigoroso pueden dar lugar al cizallamiento químico y mecánico de las células, respectivamente. La centrifugación prolongada y de alta velocidad puede resultar en la descomposición celular y altos recuentos de desechos celulares. Se requiere una concentración celular óptima para minimizar la adquisición incorrecta de eventos celulares. Por lo tanto, las suspensiones celulares primarias deben diluirse para obtener una concentración celular óptima.
Además, al manipular las muestras, se debe tener cuidado para evitar la aglutinación y fragmentación celular y garantizar que las células permanezcan en suspensión durante el análisis. El manejo de muestras para evitar la aglutinación celular permite el flujo de células laminares individuales, evita el bloqueo mecánico de los tubos capilares del instrumento y frena los índices espurios de tamaño de celda grande. Otra advertencia es proteger los cultivos contra la luz para evitar la fotooxidación y el enfriamiento de los fluoróforos en los ensayos para evitar resultados falsos negativos. Se debe tener cuidado para garantizar una exposición mínima a la luz en la etapa de tinción de las células y los pasos de procesamiento posteriores. Además, los tiempos prolongados de inmunotinción pueden dar lugar a resultados falsos positivos, ya que las proteínas se tiñen de forma no específica. Por lo tanto, la adherencia a los períodos de tinción de incubación prescritos por el fabricante es importante.
En resumen, la FC puede detectar con precisión la apoptosis y discriminar entre biomarcadores de apoptosis temprana y tardía en cultivo celular. Además, los avances en la tecnología han llevado a la fabricación de citómetros de flujo de sobremesa para científicos no expertos para estudiar la salud celular y las complejas vías de señalización intracelular.
The authors have nothing to disclose.
El estudio fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Investigación (NRF) y el Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica (SAMRC). Nos gustaría agradecer al Servicio Nacional de Laboratorios de Salud (NHLS) por la compra del analizador de células de guayaba Musa. Todas las figuras de esta publicación fueron creadas con Biorender.com.
6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |