L’apoptose peut être caractérisée par l’analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques précoces et tardifs. La lignée cellulaire du cancer du col de l’utérus, SiHa, a été analysée pour les biomarqueurs de l’apoptose après un traitement avec l’actinomycine D à l’aide d’un cytomètre de flux de paillasse.
Les biomarqueurs de l’apoptose ont été étudiés dans des cellules cancéreuses SiHa traitées à l’actinomycine D à l’aide d’un cytomètre de flux de paillasse. Les biomarqueurs précoces (annexine V et potentiel de la membrane mitochondriale) et les biomarqueurs tardifs (caspases 3 et 7 et dommages à l’ADN) de l’apoptose ont été mesurés dans des cultures expérimentales et témoins. Les cultures ont été incubées pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2. Les cellules ont ensuite été détachées à l’aide de trypsine et énumérées à l’aide d’un test de numération cellulaire cytométrique en flux. Les cellules ont ensuite été analysées pour l’apoptose à l’aide d’un test d’annexine V, d’un test de potentiel transmembranaire électrochimique mitochondrial, d’un test de caspase 3/7 et d’un test de dommages à l’ADN. Cet article fournit un aperçu de l’apoptose et de la cytométrie en flux traditionnelle, et élabore des protocoles de cytométrie en flux pour le traitement et l’analyse des cellules SiHa. Les résultats décrivent des données expérimentales positives, négatives et sous-optimales. L’interprétation et les mises en garde relatives à l’analyse cytométrique en flux de l’apoptose à l’aide de cette plateforme analytique sont également abordées. L’analyse cytométrique en flux fournit une mesure précise des biomarqueurs précoces et tardifs de l’apoptose.
L’apoptose, classée comme mort cellulaire programmée de type 11, assure un équilibre entre la prolifération cellulaire et la mort cellulaire2. L’apoptose est essentielle pendant le développement humain, après une blessure et pour la prévention de maladies telles que le cancer3. Les voies de signalisation de la mort cellulaire apoptotique intrinsèque et extrinsèque4 provoquent des changements intracellulaires biochimiques et morphologiques séquentiels 2,5,6. Les caractéristiques morphologiques apoptotiques peuvent être identifiées par microscopie et la perturbation biochimique peut être analysée par des essais biochimiques, y compris la cytométrie en flux (FC)7.
L’analyse cytométrique en flux pour identifier l’apoptose et comprendre les mécanismes intracellulaires associés a prospéré au cours des deux dernières décennies8. FC est une méthodologie scientifique qui analyse les cellules dans un fluide qui passe à travers des lasers à un ou plusieurs canaux (Figure 1)9,10,11. Les cellules du fluide sont focalisées en un seul fichier par le système fluidique du cytomètre en flux à l’aide d’une focalisation hydrodynamique. Lorsque les cellules traversent le laser, la lumière est diffusée ou émise par les cellules. La lumière diffusée peut être vers l’avant (diffusion vers l’avant) ou vers le côté (diffusion latérale) et fournit des informations sur la taille de la cellule et la granularité ou les structures internes, respectivement.
De plus, les réactifs fluorescents, tels que les colorants fluorescents ou les anticorps marqués avec des fluorophores, détectent des structures ou des molécules spécifiques de surface ou intracellulaires. Lorsque le laser excite les fluorophores, la lumière est émise à une longueur d’onde spécifique. Les détecteurs – généralement des tubes photomultiplicateurs – quantifient la lumière diffusée et émise par les échantillons de cellules. Les détecteurs produisent un courant quantifiable qui est proportionnel à la diffusion de la lumière et à l’émission de fluorescence. La sortie électronique est convertie en signaux numériques par un logiciel informatique pour identifier les populations cellulaires en fonction de la taille des cellules, de la granularité cellulaire et de la fluorescence cellulaire relative des molécules marquées au fluorophore 9,12,13.
Figure 1 : Schéma décrivant le fonctionnement technique et le flux de travail de la cytométrie en flux traditionnelle. Les cellules sont colorées avec des réactifs fluorescents et sondées par un laser. Les signaux de fluorescence générés sont détectés et convertis en une sortie électronique, qui est ensuite numérisée et analysée par des logiciels informatiques et des programmes statistiques. Abréviations : FSC = diffusion vers l’avant; SSC = dispersion latérale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
FC est utilisé à la fois dans la recherche et le diagnostic de la santé. Les deux objectifs de FC en nécrobiologie sont l’élucidation des propriétés moléculaires et fonctionnelles de la mort cellulaire et la discrimination de divers modes de mort cellulaire 14,15,16,17,18. Les applications de la FC comprennent le dénombrement des cellules, le tri des populations cellulaires, l’immunophénotypage, la détection de biomarqueurs (p. ex. biomarqueurs de l’apoptose), les études de toxicité et l’ingénierie des protéines12. En outre, la FC est couramment appliquée aux diagnostics de santé pour aider au diagnostic et à la surveillance des patients atteints de tumeurs malignes hématologiques. Les progrès réalisés dans les domaines de l’instrumentation, de la détection des fluorophores et des systèmes de détection élargissent les applications de la FC pour inclure la cytométrie d’imagerie, la cytométrie de masse et la cytométrie spectrale avec des applications de recherche plus larges12.
L’analyse cytométrique en flux de l’apoptose offre des avantages par rapport aux techniques traditionnelles utilisées pour évaluer la santé cellulaire. FC peut analyser de nombreuses cellules individuelles dans un échantillon hétérogène rapidement et de manière reproductible pour estimer l’apoptose 3,5. La capacité de FC de fournir des informations quantitatives sur les phénotypes cellulaires sur une base cellulaire individuelle et d’éviter les analyses en vrac offre une sensibilité supérieure aux techniques de Western blotting, d’immuno-enzymatique (ELISA), de fluorométrie et de spectrophotométrie utilisées dans l’analyse de l’apoptose 8,19. De plus, la facilité relative de l’analyse des tests de FC par rapport aux étapes manuelles lourdes et peu reproductibles des transferts Western et des tests ELISA est avantageuse. L’analyse reproductible, précise et à haut débit de la FC est donc bénéfique dans la recherche sur le cancer20.
FC permet également l’analyse simultanée des paramètres du cycle cellulaire pour les populations de cellules apoptotiques saines et anormales21. Comme l’apoptose est un processus dynamique, différentes méthodes peuvent produire des résultats variables et dépendent du moment où les cellules sont récoltées22. L’évaluation quantitative simultanée de multiples paramètres du phénotype cellulaire permet de détecter des sous-populations mineures avec une grande précision, par exemple, des sous-ensembles de cellules rares avec une faible fréquence de 0,01% peuvent être détectés23. L’analyse multiparamétrique de la FC est particulièrement utile car la mort apoptotique se produit le long d’un spectre de changements biochimiques précoces et tardifs avec des cellules à divers points du continuum apoptotique. Par exemple, l’utilisation d’une double coloration à l’aide d’annexine V et d’iodure de propidium dans l’analyse FC des cellules apoptotiques permet la catégorisation des cellules apoptotiques précoces, des cellules apoptotiques tardives et des cellules mortes24. La détection précise de l’apoptose à plusieurs stades évite les erreurs de classification et les résultats faussement négatifs. Ainsi, l’analyse multiparamétrique par FC améliore la spécificité globale de la détection des phénotypes cellulaires et évite la classification erronée des populations mineures. De plus, le tri cellulaire par FC permet d’isoler des populations cellulaires d’une grande pureté pour une analyse ultérieure7.
L’inconvénient de la FC comprend l’utilisation de cellules en suspension, ce qui peut être difficile dans l’analyse des tissus, car la désagrégation des tissus en cellules peut altérer la fonction cellulaire19. De plus, le manque de normalisation de la configuration des instruments FC, de l’analyse des données et des rapports d’essai peut entraîner des variations dans les résultats19, soulignant la nécessité de former de manière optimale les opérateurs FC à la performance, à l’analyse et à la communication des données. Par exemple, la capacité de FC à distinguer les vrais débris apoptotiques des noyaux apoptotiques nécessite i) des réglages d’acquisition appropriés, ii) l’utilisation de billes d’étalonnage pour identifier un pic d’ADN diploïde, et iii) des contrôles cellulaires négatifs et positifs spécifiques à la cellule3. En outre, l’analyse multiparamétrique est limitée par le nombre de détecteurs, et une compensation optimale doit être effectuée pour éviter des résultats non spécifiques et des retombées d’émissions fluorescentes lors de l’utilisation de plusieurs réactifs fluorescents25. Les progrès de la technologie des instruments et des fluorophores ont amélioré la détection des paramètres à 30 paramètres12.
L’identification de la mort cellulaire apoptotique n’est pas toujours simple7, et des biomarqueurs sensibles et spécifiques doivent être envisagés. Le Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) recommande que plus d’un test soit utilisé pour étudier et quantifier le processus d’apoptose26. L’analyse microscopique des caractéristiques apoptotiques classiques26 est également recommandée pour confirmer l’apoptose et éviter les résultats faussement positifs7. Quatre caractéristiques biochimiques cardinales qui couvrent les événements apoptotiques précoces et tardifs sont (1) la perte de l’asymétrie de la membrane cellulaire; (2) potentiel de dissipation de la membrane mitochondriale (ΔΨm); 3° l’activation des caspases; et (4) dommages à l’ADN26.
Au cours de l’apoptose précoce, la phosphatidylsérine est extériorisée à la membrane cellulaire externe 27 et peut être détectée par l’annexine V marquée par fluorescence avec la phycoérythrine27,28,29. De plus, la double coloration avec le colorant fluorescent liant l’ADN, la 7-aminoactinomycine D (7-AAD), distingue les cellules vivantes, apoptotiques tardives et mortes. Par conséquent, les cellules apoptotiques précoces se colorent positives pour l’annexine V et négatives pour le 7-AAD, contrairement aux cellules apoptotiques tardives, qui colorent positives pour les deux colorants24.
Les signaux apoptotiques intrinsèques induisent la dissipation du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm). Le ΔΨm perturbé provoque la libération précoce de protéines pro-apoptotiques de l’espace intermembranaire mitochondrial dans le cytosol27,29,30. La variation de ΔΨm peut être évaluée par double coloration avec le colorant lipophile chargé positivement, l’ester éthylique de tétraméthylrhodamine, l’EMTC et le 7-AAD. Le colorant TMRE s’accumule dans la membrane interne des mitochondries intactes lorsque le potentiel membranaire est élevé. Les mitochondries dépolarisées démontrent une diminution de la fluorescence. Les cellules vivantes avec mitochondries polarisées (membrane mitochondriale intacte) colorent positive pour TMRE et négative pour 7-AAD. Les cellules mortes avec coloration mitochondriale dépolarisée négative pour TMRE et positive pour 7-AAD31.
Les caspases sont une famille de protéases intracellulaires qui, lorsqu’elles sont activées, signalent et exécutent l’apoptose26,27. Les caspases terminales bourreaux (3,6,7) affectent l’apoptose tardive 29,32,33. Les activités des caspases-3 et -7 peuvent être mesurées par un substrat marqué par fluorescence qui, lorsqu’il est clivé, se lie à l’ADN et émet un signal fluorescent. De plus, toute atteinte à l’intégrité de la membrane cellulaire peut être évaluée par coloration au 7-AAD. Les cellules apoptotiques sont colorées positives pour le colorant liant l’ADN mais négatives pour le 7-AAD. Coloration tardive apoptotique et cellules mortes positive pour les deux colorants34.
L’apoptose tardive est caractérisée par des dommages à l’ADN27,29,35, qui peuvent être évalués par l’ataxiatelangiectasie phosphorylée kinase mutée (ATM) et l’histone H2A.X. Les cassures d’ADN double brin (DSB) provoquent la phosphorylation de H2A.X. Anticorps marqués par fluorescence contre ATM et H2A. X peut déterminer les dommages à l’ADN. Détection négative de l’ATM et du H2A. X indique qu’il n’y a pas de dommages à l’ADN, tandis que la détection des deux colorants indique la présence de cassures double brin dans l’ADN36.
L’actinomycine D est un puissant inducteur de l’apoptose et agit en se liant à l’ADN pour bloquer les événements de transcription etde traduction 37. Cette étude visait à évaluer l’apoptose biochimique induite par l’actinomycine D dans la lignée cellulaire SiHa en analysant les biomarqueurs précoces et avancés de l’apoptose. Quatre biomarqueurs biochimiques de l’apoptose ont évalué les étapes séquentielles de la cascade apoptotique qui comprenaient la perte d’asymétrie de la membrane cellulaire, le changement du potentiel de la membrane mitochondriale, l’activation des caspases terminales et les dommages à l’ADN.
Dans cette étude, les cellules SiHa traitées à l’actinomycine D analysées par FC ont révélé des biomarqueurs précoces et tardifs significatifs de l’apoptose. Les conditions sous-optimales pour la préparation, le dénombrement et la coloration des cellules ont permis d’identifier des résultats inexacts, soulignant la nécessité de respecter scrupuleusement les instructions du fabricant lors de l’exécution de la FC.
Cette étude de l’apoptose par identification précoce et tardive des biomarqueurs est conforme aux lignes directrices du NCCD1 pour l’étude de l’apoptose. Les cultures de SiHa traitées à l’actinomycine D ont démontré des biomarqueurs positifs pour les stades apoptotiques précoces et tardifs. Le test Annexin V/PI et le test de perméabilité mitochondriale ont montré que l’actinomycine D induisait respectivement un schéma PS-flip et une dissipation de la transition de la membrane mitochondriale. Une fois que les cellules apoptotiques atteignent le point de non-retour induit par la perturbation mitochondriale, les caspases terminales sont activées3,7. L’activation des caspases terminales 3 et 7 observée dans cette étude indique une apoptose à un stade avancé. De plus, l’activation terminale des caspases provoque un clivage internucléosomique de l’ADN et une fragmentation étendue de l’ADN, ce qui a été classiquement rapporté comme un modèle d’escabeau observé par électrophorèsesur gel 28,38.
Les dégâts nucléaires avec l’ATM et H2A. L’analyse des dommages à l’ADN X FC a montré des cassures double brin dans l’ADN et des dommages totaux à l’ADN. Ces résultats ont confirmé les dommages nucléaires apoptotiques classiques induits par la caspase en aval (caryorrhexis et karyorrlyse) dans des cultures expérimentales. L’utilisation de multiples biomarqueurs cytométriques en flux a ainsi détecté les événements séquentiels à plusieurs stades dans l’apoptose et identifié avec précision et reproductibilité les populations cellulaires aux stades apoptotiques précoces et tardifs. Ces résultats sont cohérents avec les caractéristiques pro-apoptotiques connues de l’actinomycine D dans le traitement du cancer chez les humains 37,39,40,41 et soutiennent davantage l’utilisation de l’actinomycine D comme témoin positif dans les expériences de culture cellulaire FC sur l’apoptose.
Le contrôle des populations cellulaires dans cette étude a été éclairé par des contrôles négatifs de milieu et de solvant, qui ont séparé les cellules apoptotiques des cellules saines. Alternativement, un mélange de populations de témoins positifs et négatifs peut également être utilisé pour définir les populations de cellules vivantes et apoptotiques afin de définir les portes de population cellulaire 7,9. Une fois que les états cellulaires malades et sains sont définis et fermés, les paramètres du modèle peuvent être appliqués à toutes les cultures expérimentales et témoins ultérieures.
Le strict respect du protocole FC est essentiel pour éviter les faux résultats. Au cours de l’optimisation du protocole, les problèmes suivants ont été observés: (1) faible concentration cellulaire, (2) concentration cellulaire élevée, (3) agglutination cellulaire, (4) coloration prolongée et (5) mauvaise manipulation des échantillons. Ces problèmes peuvent être évités par le strict respect des exigences du protocole optimisé. Cela souligne la nature cruciale des étapes préanalytiques et analytiques pour que FC obtienne des données exactes. Pendant la préparation des cellules, la trypsinisation, le pipetage, la centrifugation et les dilutions doivent être effectués avec soin. La sur-trypsinisation et le pipetage vigoureux peuvent entraîner un cisaillement chimique et mécanique des cellules, respectivement. Une centrifugation prolongée et à grande vitesse peut entraîner une dégradation cellulaire et un nombre élevé de débris cellulaires. Une concentration cellulaire optimale est nécessaire pour minimiser l’acquisition incorrecte d’événements cellulaires. Par conséquent, les suspensions de cellules primaires doivent être diluées pour obtenir une concentration cellulaire optimale.
De plus, lors de la manipulation des échantillons, il faut prendre soin d’éviter l’agglutination et la fragmentation cellulaires et de s’assurer que les cellules restent en suspension pendant l’analyse. La manipulation des échantillons pour éviter l’agglutination des cellules permet un flux de cellule laminaire unique, empêche le blocage mécanique du tube capillaire de l’instrument et freine les indices de grande taille de cellule parasites. Une autre mise en garde consiste à protéger les cultures contre la lumière pour éviter la photo-oxydation et la trempe des fluorophores dans les tests afin d’éviter les résultats faussement négatifs. Des précautions doivent être prises pour assurer une exposition minimale à la lumière à l’étape de coloration des cellules et aux étapes de traitement ultérieures. De plus, des temps d’immunomarquage prolongés peuvent entraîner des résultats faussement positifs, car les protéines ne sont pas spécifiquement colorées. Par conséquent, le respect des périodes de coloration d’incubation prescrites par le fabricant est important.
En résumé, FC peut détecter avec précision l’apoptose et faire la distinction entre les biomarqueurs de l’apoptose précoce et tardive en culture cellulaire. En outre, les progrès technologiques ont conduit à la fabrication de cytomètres de flux de paillasse pour les scientifiques non experts afin d’étudier la santé cellulaire et les voies de signalisation intracellulaires complexes.
The authors have nothing to disclose.
L’étude a été financée par la National Research Foundation (NRF) et le South African Medical Research Council (SAMRC). Nous tenons à remercier le National Health Laboratory Service (NHLS) pour l’achat de l’analyseur de cellules de goyave Muse. Toutes les figures de cette publication ont été créées avec Biorender.com.
6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |