يمكن تمييز موت الخلايا المبرمج عن طريق التحليل الخلوي للتدفق للمؤشرات الحيوية المبكرة والمتأخرة لموت الخلايا المبرمج. تم تحليل خط خلايا سرطان عنق الرحم ، SiHa ، بحثا عن المؤشرات الحيوية لموت الخلايا المبرمج بعد العلاج بالأكتينومايسين D باستخدام مقياس التدفق الخلوي على الطاولة.
تم فحص المؤشرات الحيوية لموت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان عنق الرحم SiHa المعالجة بالأكتينومايسين D باستخدام مقياس التدفق الخلوي على الطاولة. تم قياس المؤشرات الحيوية المبكرة (الملحق الخامس وإمكانية غشاء الميتوكوندريا) والمؤشرات الحيوية المتأخرة (caspases 3 و 7 ، وتلف الحمض النووي) لموت الخلايا المبرمج في الثقافات التجريبية والضابطة. تم تحضين الثقافات لمدة 24 ساعة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. ثم تم فصل الخلايا باستخدام التربسين وتعدادها باستخدام مقايسة عدد الخلايا الخلوية للتدفق. تم تحليل الخلايا بشكل أكبر بحثا عن موت الخلايا المبرمج باستخدام مقايسة Annexin V ، ومقايسة محتملة عبر الغشاء الكهروكيميائية للميتوكوندريا ، ومقايسة كاسباز 3/7 ، ومقايسة تلف الحمض النووي. تقدم هذه المقالة نظرة عامة على موت الخلايا المبرمج وقياس التدفق الخلوي التقليدي ، وتوضح بروتوكولات قياس التدفق الخلوي لمعالجة وتحليل خلايا SiHa. تصف النتائج البيانات التجريبية الإيجابية والسلبية ودون المستوى الأمثل. كما تمت مناقشة التفسير والمحاذير في إجراء تحليل التدفق الخلوي لموت الخلايا المبرمج باستخدام هذه المنصة التحليلية. يوفر تحليل التدفق الخلوي قياسا دقيقا للمؤشرات الحيوية المبكرة والمتأخرة لموت الخلايا المبرمج.
موت الخلايا المبرمج ، المصنف علىأنه موت الخلايا المبرمج من النوع 1 1 ، يضمن التوازن بين تكاثر الخلايا وموت الخلايا2. موت الخلايا المبرمج ضروري أثناء التنمية البشرية ، وبعد الإصابة ، وللوقاية من أمراض مثل السرطان3. تتسبب مسارات إشارات موت الخلايا المبرمج الداخلية والخارجية4 في حدوث تغيرات كيميائية حيوية ومورفولوجية متسلسلة داخل الخلايا2،5،6. يمكن تحديد السمات المورفولوجية لموت الخلايا المبرمج عن طريق الفحص المجهري ، ويمكن تحليل الاضطراب الكيميائي الحيوي بواسطة المقايسات الكيميائية الحيوية ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي (FC)7.
ازدهر تحليل التدفق الخلوي لتحديد موت الخلايا المبرمج وفهم الآليات المرتبطة داخل الخلايا على مدى العقدين الماضيين8. FC هي منهجية علمية تحلل الخلايا في سائل يمر عبر ليزر أحادي أو متعدد القنوات (الشكل 1)9,10,11. يتم تركيز الخلايا الموجودة في السائل في ملف واحد بواسطة نظام الموائع لمقياس التدفق الخلوي باستخدام التركيز الهيدروديناميكي. عندما تمر الخلايا عبر الليزر ، يتشتت الضوء أو ينبعث من الخلايا. يمكن أن يكون الضوء المبعثر في الاتجاه الأمامي (التشتت الأمامي) أو باتجاه الجانب (التشتت الجانبي) ويوفر معلومات حول حجم الخلية ودقة الخلية أو الهياكل الداخلية ، على التوالي.
بالإضافة إلى ذلك ، تكتشف الكواشف الفلورية ، مثل الأصباغ الفلورية أو الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفورات ، هياكل أو جزيئات سطحية أو داخل الخلايا محددة. عندما يثير الليزر الفلوروفورات ، ينبعث الضوء عند طول موجي معين. تقوم أجهزة الكشف – عادة أنابيب المضاعف الضوئي – بتحديد كمية الضوء المتناثر والمنبعث من عينات الخلايا. تنتج أجهزة الكشف تيارا قابلا للقياس الكمي يتناسب مع تشتت الضوء وانبعاث التألق. يتم تحويل الإخراج الإلكتروني إلى إشارات رقمية عن طريق برنامج الحوسبة لتحديد مجموعات الخلايا بناء على حجم الخلية ودقة الخلية ومضان الخلية النسبي للجزيئات ذات العلامات الفلورية9،12،13.
الشكل 1: رسم تخطيطي يصف العملية الفنية وسير العمل لقياس التدفق الخلوي التقليدي. الخلايا ملطخة بكواشف الفلورسنت ويتم فحصها بواسطة الليزر. يتم الكشف عن إشارات التألق المتولدة وتحويلها إلى مخرجات إلكترونية ، والتي يتم رقمنتها وتحليلها بواسطة برامج الكمبيوتر والبرامج الإحصائية. الاختصارات: FSC = مبعثر أمامي ؛ SSC = مبعثر جانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يستخدم FC في كل من البحوث والتشخيص الصحي. الهدفان من FC في علم الأحياء الميت هما توضيح الخصائص الجزيئية والوظيفية لموت الخلايا والتمييز بين أنماط مختلفة من موت الخلايا14،15،16،17،18. تشمل تطبيقات FC تعداد الخلايا ، وفرز مجموعات الخلايا ، والتنميط المناعي ، والكشف عن العلامات الحيوية (على سبيل المثال ، المؤشرات الحيوية لموت الخلايا المبرمج) ، ودراسات السمية ، وهندسة البروتين12. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تطبيق FC بشكل شائع على التشخيص الصحي للمساعدة في تشخيص ومراقبة المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية. تعمل التطورات في الأجهزة والكشف عن الفلوروفور وأنظمة الكشف على توسيع تطبيقات FC لتشمل القياس الخلوي التصويري وقياس الكتلة الخلوية والقياس الخلوي الطيفي مع تطبيقات بحثية أوسع12.
يوفر تحليل التدفق الخلوي لموت الخلايا المبرمج مزايا على التقنيات التقليدية المستخدمة في تقييم صحة الخلايا. يمكن ل FC تحليل العديد من الخلايا المفردة في عينة غير متجانسة بسرعة وبشكل متكرر لتقدير موت الخلايا المبرمج 3,5. توفر قدرة FC على توفير معلومات كمية عن الأنماط الظاهرية للخلايا على أساس الخلية الفردية ، وتجنب التحليل بالجملة ، حساسية فائقة للنشاف الغربي ، ومقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) ، والقياس الفلوري ، وتقنيات القياس الطيفي المستخدمة في تحليل موت الخلايا المبرمج8،19. علاوة على ذلك ، فإن السهولة النسبية لتحليل FC على عكس الخطوات اليدوية المرهقة وغير القابلة للتكرار بشكل سيئ للبقع الغربية و ELISAs مفيدة. وبالتالي ، فإن التحليل القابل للتكرار والدقيق وعالي الإنتاجية ل FC مفيد في أبحاث السرطان20.
يسمح FC أيضا بالتحليل المتزامن لمعلمات دورة الخلية لمجموعات الخلايا المبرمج السليمة وغير الطبيعية21. نظرا لأن موت الخلايا المبرمج عملية ديناميكية ، يمكن أن تؤدي الطرق المختلفة إلى نتائج متغيرة وتعتمد على النقطة الزمنية التي يتم فيها حصاد الخلايا22. يسمح التقييم الكمي المتزامن للمعلمات المتعددة للنمط الظاهري للخلية بالكشف عن مجموعات فرعية ثانوية بدقة عالية ، على سبيل المثال ، يمكن اكتشاف مجموعات فرعية من الخلايا النادرة ذات التردد المنخفض بنسبة 0.01٪23. يعد تحليل FC متعدد المعلمات مفيدا بشكل خاص حيث يحدث موت الخلايا المبرمج على طول مجموعة من التغيرات الكيميائية الحيوية المبكرة والمتأخرة مع الخلايا في نقاط مختلفة على طول سلسلة موت الخلايا المبرمج. على سبيل المثال ، يتيح استخدام التلوين المزدوج باستخدام Annexin V ويوديد البروبيديوم في تحليل FC للخلايا المبرمج تصنيف الخلايا المبرمج المبكرة والخلايا المبرمج المتأخرة والخلايا الميتة24. يؤدي الكشف الدقيق عن موت الخلايا المبرمج في مراحل متعددة إلى تجنب التصنيف الخاطئ والنتائج السلبية الكاذبة. وبالتالي ، فإن التحليل متعدد المعلمات بواسطة FC يحسن الخصوصية العامة للكشف عن الأنماط الظاهرية للخلايا ويتجنب التصنيف الخاطئ للسكان الثانويين. علاوة على ذلك ، يسمح فرز الخلايا بواسطة FC بعزل مجموعات الخلايا ذات النقاء العالي للتحليل اللاحق7.
يشمل عيب FC استخدام الخلايا في التعليق ، والذي يمكن أن يكون صعبا في تحليل الأنسجة ، لأن تصنيف الأنسجة إلى خلايا قد يغير الوظيفة الخلوية19. وعلاوة على ذلك، فإن عدم توحيد إعداد أجهزة التيسير المالي، وتحليل البيانات، وتقارير الفحص قد يتسبب في تباين النتائج19، مما يؤكد الحاجة إلى التدريب الأمثل لمشغلي التدفقات المالية على أداء البيانات وتحليلها والإبلاغ عنها. على سبيل المثال ، تتطلب قدرة FC على تمييز الحطام الحقيقي لموت الخلايا المبرمج من نوى موت الخلايا المبرمج i) إعدادات اكتساب مناسبة ، ii) استخدام حبات المعايرة لتحديد ذروة الحمض النووي ثنائية الصيغة الصبغية ، و iii) عناصر التحكم في الخلايا السلبية والإيجابية الخاصة بالخلية3. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل المتعدد المعلمات محدود بعدد أجهزة الكشف، ويلزم إجراء التعويض الأمثل لتجنب النتائج غير المحددة وامتداد الانبعاثات الفلورية عند استخدام كواشف فلورية متعددة25. أدى التقدم في تكنولوجيا الأدوات والفلوروفور إلى تحسين الكشف عن المعلمات إلى 30 معلمة12.
تحديد موت الخلايا المبرمج ليس دائما بسيطا7 ، ويجب مراعاة المؤشرات الحيوية الحساسة والمحددة. توصي لجنة التسميات المعنية بموت الخلايا (NCCD) باستخدام أكثر من اختبار واحد لدراسة وتحديد عملية موت الخلايا المبرمج26. يوصى أيضا بالتحليل المجهري لميزات موت الخلايا المبرمج الكلاسيكية26 لتأكيد موت الخلايا المبرمج وتجنب النتائج الإيجابية الكاذبة7. أربع ميزات كيميائية حيوية أساسية تمتد عبر أحداث موت الخلايا المبرمج المبكرة والمتأخرة هي (1) فقدان عدم تناسق غشاء الخلية. (2) تبديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) ؛ (3) تفعيل الكاسباس ؛ و (4) تلف الحمض النووي26.
أثناء موت الخلايا المبرمج المبكر ، يتم إخراج الفوسفاتيديل سيرين إلى غشاء الخلية الخارجي 27 ويمكن اكتشافه بواسطة Annexin V المسمى بالفلورسنت مع phycoerythrin27،28،29. علاوة على ذلك ، فإن التلوين المزدوج مع صبغة ربط الحمض النووي الفلورية ، 7-aminoactinomycin D (7-AAD) ، يميز الخلايا الحية والمتأخرة والميتة. لذلك ، فإن الخلايا المبرمج المبكرة تلطخ إيجابية ل Annexin V وسالبة ل 7-AAD ، على عكس الخلايا المبرمج المتأخرة ، التي تلطخ إيجابية لكلا الصبغتين24.
تحفز إشارات موت الخلايا المبرمج الجوهرية تبديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm). يتسبب اضطراب ΔΨm في إطلاق بروتينات مبكرة مؤيدة لموت الخلايا المبرمج من الفضاء بين غشاء الميتوكوندريا إلى السيتوسول27،29،30. يمكن تقييم التغير في ΔΨm عن طريق التلوين المزدوج باستخدام صبغة موجبة الشحنة ، محبة للدهون ، إستر إيثيل رباعي ميثيل رودامين ، TMRE ، و 7-AAD. تتراكم صبغة TMRE داخل الغشاء الداخلي للميتوكوندريا السليمة عندما تكون إمكانات الغشاء عالية. تظهر الميتوكوندريا غير المستقطبة انخفاضا في التألق. الخلايا الحية ذات الميتوكوندريا المستقطبة (غشاء الميتوكوندريا السليم) تلطخ إيجابية ل TMRE وسلبية ل 7-AAD. الخلايا الميتة ذات الميتوكوندريا غير المستقطبة سلبية ل TMRE وإيجابية ل 7-AAD31.
ال caspases هي عائلة من البروتياز داخل الخلايا التي ، عند تنشيطها ، تشير وتنفذ موت الخلايا المبرمج26,27. الجلاد النهائي caspases (3،6،7) تأثير موت الخلايا المبرمج في وقت متأخر29،32،33. يمكن قياس أنشطة Caspase-3 و -7 بواسطة ركيزة موسومة بالفلورسنت ، والتي ، عند شقها ، ترتبط بالحمض النووي وتصدر إشارة فلورسنت. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم أي حل وسط لسلامة غشاء الخلية عن طريق تلطيخ 7-AAD. الخلايا المبرمج تلطخ إيجابية للصبغة المرتبطة بالحمض النووي ولكنها سلبية ل 7-AAD. الخلايا المبرمج المتأخرة والميتة وصمة عار إيجابية لكلا الأصباغ34.
يتميز موت الخلايا المبرمج المتأخر بتلف الحمض النووي27،29،35 ، والذي يمكن تقييمه عن طريق الرنح المفسفر وكيناز المتحور (ATM) وهيستون H2A.X. تتسبب فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل (DSBs) في فسفرة H2A.X. الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية ضد ATM و H2A. X يمكن أن يحدد تلف الحمض النووي. الكشف السلبي عن كل من أجهزة الصراف الآلي و H2A. يشير X إلى عدم وجود تلف في الحمض النووي ، بينما يشير اكتشاف كلا الصبغتين إلى وجود فواصل مزدوجة الخيوط في الحمض النووي36.
الأكتينومايسين D هو محفز قوي لموت الخلايا المبرمج ويعمل عن طريق الارتباط بالحمض النووي لمنع أحداث النسخ والترجمة37. تهدف هذه الدراسة إلى تقييم موت الخلايا المبرمج الكيميائي الحيوي الناجم عن الأكتينومايسين D في خط خلايا SiHa من خلال تحليل المؤشرات الحيوية المبكرة والمتأخرة لموت الخلايا المبرمج. قامت أربعة مؤشرات حيوية كيميائية حيوية لموت الخلايا المبرمج بتقييم الخطوات المتسلسلة في سلسلة موت الخلايا المبرمج التي تضمنت فقدان عدم تناسق غشاء الخلية ، والتغيير في إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتنشيط الكاسباس الطرفي ، وتلف الحمض النووي.
في هذه الدراسة ، كشفت خلايا SiHa المعالجة بالأكتينومايسين D التي تم تحليلها بواسطة FC عن مؤشرات حيوية مبكرة ومتأخرة لموت الخلايا المبرمج. حددت الظروف دون المثلى لإعداد الخلايا والتعداد والتلوين نتائج غير دقيقة ، مما يؤكد الحاجة إلى الالتزام الوثيق بتعليمات الشركة المصنعة عند إجراء FC.
تتوافق هذه الدراسة حول موت الخلايا المبرمج عن طريق تحديد العلامات الحيوية المبكرة والمتأخرة مع إرشادات NCCD1 للتحقيق في موت الخلايا المبرمج. أظهرت مزارع SiHa المعالجة بالأكتينومايسين D مؤشرات حيوية إيجابية لمراحل موت الخلايا المبرمج المبكرة والمتأخرة. أظهر فحص Annexin V / PI ومقايسة نفاذية الميتوكوندريا أن الأكتينومايسين D تسبب في نمط PS-flip وتبديد انتقال غشاء الميتوكوندريا ، على التوالي. بمجرد وصول الخلايا المبرمج إلى نقطة اللاعودة الناجمة عن اضطراب الميتوكوندريا ، يتم تنشيط الكاسباز الطرفي 3,7. يشير تنشيط caspases الطرفي 3 و 7 الذي لوحظ في هذه الدراسة إلى موت الخلايا المبرمج في المرحلة المتأخرة. علاوة على ذلك ، يتسبب تنشيط الكاسباز النهائي في انقسام الحمض النووي بين النواة وتجزئة الحمض النووي على نطاق واسع ، والذي تم الإبلاغ عنه بشكل كلاسيكي كنمط سلم متدرج لوحظ بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي28,38.
الضرر النووي مع أجهزة الصراف الآلي و H2A. أظهر فحص تلف الحمض النووي X FC فواصل مزدوجة في الحمض النووي وتلف إجمالي للحمض النووي. أكدت هذه النتائج الضرر النووي الكلاسيكي الناجم عن الكاسباس (karyorrhexis و karyorrlysis) في الثقافات التجريبية. وهكذا كشف استخدام المؤشرات الحيوية للتدفق الخلوي المتعدد عن الأحداث المتسلسلة متعددة المراحل في موت الخلايا المبرمج وتم تحديد مجموعات الخلايا بدقة وتكرار في المراحل المبكرة والمتأخرة من موت الخلايا المبرمج. تتوافق هذه النتائج مع السمات المعروفة المؤيدة لموت الخلايا المبرمج للأكتينومايسين D في علاج السرطان لدى البشر37،39،40،41 وتدعم أيضا استخدام الأكتينومايسين D كعنصر تحكم إيجابي في تجارب زراعة الخلايا FC التي تبحث في موت الخلايا المبرمج.
تم إبلاغ بوابات مجموعات الخلايا في هذه الدراسة من خلال الضوابط السلبية للوسط والمذيبات ، والتي فصلت موت الخلايا المبرمج عن الخلايا السليمة. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام مزيج من مجموعات الضوابط الإيجابية والسلبية لتحديد مجموعات الخلايا الحية وموت الخلايا المبرمج لتعيين بوابات سكان الخلايا 7,9. بمجرد تحديد الحالات الخلوية المريضة والصحية وبوابها ، يمكن تطبيق إعدادات القالب على جميع الثقافات التجريبية والضابطة اللاحقة.
الالتزام الصارم ببروتوكول FC ضروري لتجنب النتائج الخاطئة. أثناء تحسين البروتوكول ، لوحظت المشاكل التالية: (1) تركيز منخفض للخلايا ، (2) تركيز مرتفع للخلايا ، (3) تكتل الخلايا ، (4) تلطيخ طويل الأمد ، و (5) سوء معالجة العينات. يمكن منع هذه المشاكل من خلال الالتزام الصارم بمتطلبات البروتوكول المحسنة. وهذا يؤكد الطبيعة الحاسمة للخطوات ما قبل التحليلية والتحليلية لهيئة التيسير للحصول على بيانات دقيقة. أثناء تحضير الخلية ، يجب إجراء التربسين ، والامتصاص ، والطرد المركزي ، والتخفيفات بعناية. قد يؤدي الإفراط في التربسين والامتصاص القوي إلى القص الكيميائي والميكانيكي للخلايا ، على التوالي. قد يؤدي الطرد المركزي المطول وعالي السرعة إلى انهيار الخلايا وارتفاع عدد الحطام الخلوي. مطلوب تركيز الخلية الأمثل لتقليل الاستحواذ غير الصحيح لأحداث الخلية. لذلك ، يجب تخفيف معلقات الخلايا الأولية للحصول على التركيز الأمثل للخلايا.
علاوة على ذلك ، أثناء التعامل مع العينات ، يجب توخي الحذر لمنع تكتل الخلايا وتجزئتها وضمان بقاء الخلايا معلقة أثناء التحليل. تسمح معالجة العينات لمنع تكتل الخلايا بتدفق خلية رقائقية واحدة ، وتمنع الانسداد الميكانيكي للأنبوب الشعري للأداة ، وتحد من مؤشرات حجم الخلية الكبيرة الزائفة. تحذير آخر هو حماية الثقافات من الضوء لتجنب الأكسدة الضوئية وإخماد الفلوروفورات في المقايسات لمنع النتائج السلبية الكاذبة. يجب توخي الحذر لضمان الحد الأدنى من التعرض للضوء في خطوة تلطيخ الخلايا وخطوات المعالجة اللاحقة. علاوة على ذلك ، قد تؤدي أوقات التلوين المناعي المطولة إلى نتائج إيجابية كاذبة لأن البروتينات غير ملطخة على وجه التحديد. لذلك ، من المهم الالتزام بفترات تلطيخ الحضانة التي تحددها الشركة المصنعة.
باختصار ، يمكن ل FC اكتشاف موت الخلايا المبرمج بدقة والتمييز بين المؤشرات الحيوية المبكرة والمتأخرة لموت الخلايا المبرمج في زراعة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، أدى التقدم في التكنولوجيا إلى تصنيع أجهزة قياس التدفق الخلوي الموضوعة على الطاولة للعلماء غير الخبراء لدراسة صحة الخلايا ومسارات الإشارات المعقدة داخل الخلايا.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) ومجلس البحوث الطبية في جنوب إفريقيا (SAMRC). نود أن نعرب عن تقديرنا لخدمة المختبرات الصحية الوطنية (NHLS) لشراء محلل خلايا الجوافة Muse. تم إنشاء جميع الأرقام في هذا المنشور مع Biorender.com.
6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |