Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares

Summary

Aquí, presentamos un ensayo de co-cultivo fácil de usar para analizar la migración de glioblastoma (GBM) en neuronas modeladas. Desarrollamos una macro en el software FiJi para una fácil cuantificación de la migración de células GBM en las neuronas, y observamos que las neuronas modifican la capacidad invasiva de las células GBM.

Abstract

Los glioblastomas (GBMs), gliomas malignos de grado IV, son uno de los tipos más mortales de cáncer humano debido a sus características agresivas. A pesar de los avances significativos en la genética de estos tumores, cómo las células GBM invaden el parénquima cerebral sano no se entiende bien. En particular, se ha demostrado que las células GBM invaden el espacio peritumoral a través de diferentes rutas; el principal interés de este trabajo es la ruta a lo largo de los tractos de materia blanca (WMTs). Las interacciones de las células tumorales con los componentes de la célula nerviosa peritumoral no están bien caracterizadas. Aquí, se ha descrito un método que evalúa el impacto de las neuronas en la invasión celular GBM. Este papel presenta un análisis in vitro avanzado de la co-cultura que mímico la invasión de WMT analizando la migración de GBM vástago-como las células en neuronas. El comportamiento de las células GBM en presencia de neuronas se monitorea mediante el uso de un procedimiento de seguimiento automatizado con software de código abierto y de libre acceso. Este método es útil para muchas aplicaciones, en particular, para estudios funcionales y mecanicistas, así como para analizar los efectos de los agentes farmacológicos que pueden bloquear la migración celular GBM en las neuronas.

Introduction

Las gliomas malas primarias, incluyendo GBMs, son tumores devastadores, con una tasa de supervivencia media de 12 a 15 meses divulgada para los pacientes de GBM. La terapia actual se basa en la resección de la masa tumoral grande y la quimioterapia juntadas con la radioterapia, que extiende solamente la tasa de supervivencia por pocos meses. Los fracasos terapéuticos están íntimamente relacionados con la mala administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y con el crecimiento invasivo en espacios perivascularios, meninges y a lo largo de las TMM¹. La invasión perivascularia, también llamada cooptación vascular, es un proceso bien estudiado, y los mecanismos moleculares están empezando a dilucidarse; sin embargo, el proceso de invasión de células GBM a lo largo de wmts no se entiende bien. Las células tumorales migran al cerebro sano a lo largo de las estructuras secundarias de Scherer². De hecho, hace casi un siglo, Hans-Joachim Scherer describió las rutas invasivas de gbm, que ahora se conocen como satellitosis perineuronal, satellitosis perivascularia, propagación subagal, e invasión a lo largo de la WMT (Figura 1A).

Algunas quimiocinas y sus receptores, como el factor-1α derivado de células del estroma (SDF1α) y el receptor de quimioquinas C-X-C (CXCR4), pero no el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), parecen estar implicados en la invasión de WMT^3. Más recientemente, se ha demostrado que un eje NOTCH1-SOX2 transcelular es una vía importante en la invasión WMT de células GBM^4. Los autores describieron cómo gbm stem-like células invaden el parénquima cerebral en las neuronas parcialmente unmyelinated, lo que sugiere la destrucción de las hellas de mielina por las células GBM. Un hito se alcanzó en 2019 cuando se publicaron de formaconsecutiva tres artículos en la revista Nature, subrayando el papel de la actividad eléctrica en el desarrollo del glioma^5,6. El trabajo seminal de Monje y colaboradores arrojó luz sobre el papel central de la actividad eléctrica en la secreción de neuroligina-3, que promueve el desarrollo del glioma.

Winkler y colaboradores describieron las conexiones entre las células GBM (microtubos) siendo cruciales en los pasos invasivos, y últimamente, las interacciones entre las células GBM y las neuronas a través de las sinapsis neuroglioma recientemente descritas. Esas estructuras favorecen el estímulo glutamatérgico de los receptores α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) situados en la membrana celular de GBM, que promueve el desarrollo y la invasión del tumor. La invasión de células tumorales es un proceso central en la diseminación de metástasis o focos secundarios distantes, como se observa en pacientes con GBM. Se han identificado varios factores importantes en la invasión de GBM, como la trombospondina-1, un factor de crecimiento transformante beta (proteína matricelular regulada por TGFβ, o el receptor de quimioquinas CXCR3)^7,8.

Aquí, se ha descrito un modelo biomimético simplificado para estudiar la invasión gbm, en la que las neuronas se modelan en pistas de laminina, y las células GBM se siembran en ella, como uni células o como esferoides (Figura 1B). Los dos entornos experimentales están dirigidos a recapitular la invasión en las neuronas, que se observa en GBM^9,10,11. Tales modelos han sido desarrollados en el pasado como biomateriales de nanofibra alineados (electrospinning core-shell) que permiten estudiar la migración celular mediante la modulación de propiedades mecánicas o químicas^12. El modelo de co-cultivo descrito en este artículo permite una mejor comprensión de cómo las células GBM escapan en las neuronas mediante la definición de nuevas vías moleculares involucradas en este proceso.

Protocol

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes (del Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acuerdo con las regulaciones del comité de ética local). Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética de la investigación humana y animal de la Universidad de Burdeos. Las ratas embarazadas fueron alojadas y tratadas en las instalaciones para animales de la Universidad de Burdeos. La eutanasia de una rata embarazada de E18-timed fue realizada usando elCO2. Todos los procedi…

Representative Results

Las neuronas modeladas co-cultivadas con las células fluorescentes de GBM fueron preparadas según lo descrito en la sección del protocolo, y los experimentos de seguimiento fueron realizados. Las células GBM modificaron rápidamente su forma mientras migraban sobre las neuronas (Figura 1B:panel 6 y Video 1). Las células migraron a lo largo de las extensiones neuronales, en un movimiento aleatorio (Video 1). Las células fluorescentes GB…

Discussion

Los glioblastomas invaden ampliamente el parénquima mediante el uso de diferentes modos: cooptación de los vasos sanguíneos circundantes, invasión intersticial o invasión en las TMM¹⁸. Este último modo no se caracteriza bien en la literatura debido a la dificultad en encontrar los modelos ines vitro o in vivo convenientes relacionados con la invasión de WMT. Aquí, se ha propuesto un modelo simplificado en el que las neuronas de roedores cultivadas se modelaron en superfic…

Materials

(3-aminopropyl) triethoxysilane	Sigma	440140-100ML	The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate	Sarstedt	2582624	Used to prepare spheroids
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides	Invitrogen	C10283	Used to cell counting
Coverslips	Marienfeld	111580	Cell culture substrate
Dessicator cartridges	Sigma	Z363456-6EA	Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm²	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Heparin sodium	Sigma	H3149-100KU	Stored at 4 °C
Laminin		114956-81-9	Promotes neuronal adhesion
Leonardo software			loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software	Molecular Devices LLC	NA	Microscopy automation software
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)			inverted microscope equipped with a motorized stage
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
PLPP	Alveole	PLPPclassic_1ml	Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	Used as an anti-fouling coating
PRIMO	Alveole	PRIMO1	Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used for cell counting
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ML	Used to detach adherent cells