胶质母细胞瘤干细胞在模式神经元上共同培养，以研究迁移和细胞相互作用
Summary
在这里，我们提出了一个易于使用的共培养检测，以分析胶质母细胞瘤（GBM）迁移的模式神经元。我们在FiJi软件中开发了一个宏，用于简单量化神经元上的GBM细胞迁移，并观察到神经元会改变GBM细胞的侵入能力。
Abstract
胶质母细胞瘤（GBMs），四级恶性胶质瘤，是人类癌症中最致命的类型之一，因为它们具有攻击性特征。尽管这些肿瘤的遗传学取得了重大进展，但GBM细胞如何侵入健康的脑帕伦奇马尚不清楚。值得注意的是，已证明GBM细胞通过不同的途径侵入永久空间：本文的主要兴趣是沿白质区（WMTs）的路线。肿瘤细胞与围产神经细胞成分的相互作用特征不充分。在此，描述了一种评估神经元对GBM细胞入侵的影响的方法。本文通过分析神经元上GBM干细胞的迁移，提出了一种先进的体外共培养检测，模拟WMT入侵。使用开源和自由访问软件的自动跟踪程序对GBM细胞在神经元存在时的行为进行监控。这种方法对许多应用都很有用，特别是对于功能和机械学研究，以及分析药理制剂对阻止GBM细胞迁移对神经元的影响。
Introduction
原发性恶性胶质瘤，包括GBM，是毁灭性的肿瘤，GBM患者的中等存活率为12至15个月。目前的治疗依赖于大肿瘤大规模切除和化疗加上放射治疗，这只会延长几个月的存活率。治疗失败与跨血脑屏障（BBB）的不良药物输送以及血管间空间、脑膜和WMT1沿线的侵入性生长密切相关。血管入侵，也称为血管共同选择，是一个经过充分研究的过程，分子机制开始被阐明：然而，沿WMT的GBM细胞入侵过程并不被很好地理解。肿瘤细胞沿着舍勒的次生结构2迁移到健康的大脑中。事实上，近一个世纪前，汉斯-约阿希姆·舍勒描述了GBM的侵入性路线，现在被称为腹膜饱腹症、腹膜饱腹症、亚皮亚传播和沿WMT（图1A）的入侵。
一些化疗因子及其受体，如频闪细胞衍生因子-1+（SDF1+）和C-X-C图案化学素受体4（CXCR4），但不是血管内皮生长因子（VEGF），似乎与WMT入侵3有关。最近，一个跨细胞的T1-SOX2轴已被证明是WMT入侵GBM细胞4的重要途径。作者描述了GBM干细胞如何侵入部分未髓化神经元的脑帕奇玛，这表明GBM细胞对骨髓护套的破坏。2019年，《自然》杂志发表了三篇文章，强调了电活动在胶质瘤发育中的作用。Monje 和合作者的开创性工作揭示了电活动在神经质-3分泌中的核心作用，这种分泌物促进胶质瘤的发展。
Winkler和合作者描述了GBM细胞（微管）之间的连接在侵入性步骤中至关重要，最近，GBM细胞和神经元之间通过新描述的神经胶质瘤突触相互作用。这些结构有利于对位于GBM细胞膜的α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异氧丙烯酸（AMPA）受体进行谷氨酸刺激，从而促进肿瘤的发展和入侵。肿瘤细胞入侵是转移或远继发的传播过程中的一个中心过程，如GBM患者所观察到的。已确定在GBM入侵中很重要的几个因素，如血栓蓬丁-1，一种转化生长因子β（TGF+调节的基质细胞蛋白，或化学素受体CXCR3）7，8。
在这里，一个简化的生物仿生模型被描述为研究GBM入侵，其中神经元在层压素的轨道上成型，GBM细胞作为单细胞或球体（图1B）播种到它上面。这两个实验设置旨在回顾神经元的入侵，这是在GBM9，10，11观察到的。这种模型过去曾被开发成对齐的纳米纤维生物材料（核心壳电平），允许通过调节机械或化学特性12来研究细胞迁移。本文中描述的共同培养模型通过定义这个过程中涉及的新分子通路，可以更好地了解 GBM 细胞如何逃逸到神经元上。
Protocol
Representative Results
Discussion
胶质母细胞瘤广泛入侵帕奇马使用不同的模式：共同选择周围的血管，间歇性入侵，或在WMTs18入侵。后一种模式在文献中没有很好的特征，因为很难找到合适的体外或体内模型与WMT入侵有关。在这里，提出了一个简化的模型，其中培养啮齿动物神经元在层压涂层表面上进行图案，荧光GBM干细胞在神经元之上播种。本研究采用网格形状模式，改进肿瘤细胞附着、入侵?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了ARC基金会2020年，联赛癌症（吉隆德委员会），ARTC，计划癌症2021年，INCA PLBIO的支持。阿尔韦奥勒得到国家雷彻奇（格兰特·拉贝克斯·布雷恩-10-LABX-43）的支持。乔里斯·古永是图卢兹大学医院（楚图卢兹）的奖学金获得者。
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
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