Summary

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Published: February 24, 2021
doi:

Summary

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Abstract

Glioblastomen (GBM’s), graad IV kwaadaardige gliomen, zijn een van de dodelijkste soorten menselijke kanker vanwege hun agressieve kenmerken. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de genetica van deze tumoren, is hoe GBM-cellen het gezonde hersenparenchym binnendringen niet goed begrepen. Met name is aangetoond dat GBM-cellen via verschillende routes de peritumorale ruimte binnendringen; het belangrijkste belang van dit document is de route langs witte stof traktaten (WMT’s). De interacties van tumorcellen met de peritumorale zenuwcelcomponenten worden niet goed gekarakteriseerd. Hierin is een methode beschreven die de impact van neuronen op GBM-celinvasie evalueert. Dit artikel presenteert een geavanceerde co-cultuur in vitro assay die WMT invasie nabootst door de migratie van GBM stam-achtige cellen op neuronen te analyseren. Het gedrag van GBM-cellen in aanwezigheid van neuronen wordt gemonitord met behulp van een geautomatiseerde trackingprocedure met open-source en free-access software. Deze methode is nuttig voor veel toepassingen, met name voor functionele en mechanistische studies en voor het analyseren van de effecten van farmacologische middelen die GBM-celmigratie op neuronen kunnen blokkeren.

Introduction

Primaire kwaadaardige gliomen, waaronder GBM’s, zijn verwoestende tumoren, met een gemiddelde overlevingskans van 12 tot 15 maanden gerapporteerd voor GBM-patiënten. De huidige therapie is gebaseerd op grote tumormassaresectie en chemotherapie in combinatie met radiotherapie, die de overlevingskans slechts met enkele maanden verlengt. Therapeutische mislukkingen zijn nauw verbonden met slechte medicijnafgifte over de bloed – hersenbarrière (BBB) en met invasieve groei in perivasculaire ruimten, hersenvliezen en langsMGT’s 1. Perivasculaire invasie, ook wel vasculaire co-optie genoemd, is een goed bestudeerd proces en de moleculaire mechanismen beginnen te worden opgehelderd; het proces van GBM-celinvasie langs MVW’s is echter niet goed begrepen. Tumorcellen migreren naar de gezonde hersenen langs de secundaire structuren van Scherer2. Bijna een eeuw geleden beschreef Hans-Joachim Scherer de invasieve routes van GBM, die nu worden aangeduid als perineuronale satellitose, perivasculaire satellitose, subpiale verspreiding en invasie langs de WMT (figuur 1A).

Sommige chemokinen en hun receptoren, zoals stromale cel-afgeleide factor-1α (SDF1α) en C-X-C motief chemokine receptor 4 (CXCR4), maar niet vasculaire endotheel groeifactor (VEGF), lijken betrokken te zijn bij WMT invasie3. Meer recentelijk is aangetoond dat een transcellulaire NOTCH1-SOX2-as een belangrijke route is in WMT-invasie van GBM-cellen4. De auteurs beschreven hoe GBM-stamachtige cellen het hersenparenchym binnendringen op gedeeltelijk ongemyelineeerde neuronen, wat wijst op de vernietiging van myelinescheden door GBM-cellen. Een mijlpaal werd bereikt in 2019 toen drie artikelenconsecutief werden gepubliceerd in het tijdschrift Nature , waarin de rol van elektrische activiteit in de ontwikkeling van glioom werd onderstreept5,6. Baanbrekend werk van Monje en medewerkers werpt licht op de centrale rol van elektrische activiteit in de afscheiding van neuroligine-3, die de ontwikkeling van glioom bevordert.

Winkler en medewerkers beschreven dat verbindingen tussen GBM-cellen (microtubes) cruciaal zijn in invasieve stappen, en de laatste tijd interacties tussen GBM-cellen en neuronen via nieuw beschreven neuroglioomsynapsen. Die structuren bevorderen glutamatergische stimulatie van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropioninezuur (AMPA) receptoren gelegen op het GBM celmembraan, die tumorontwikkeling en invasie bevordert. Tumorcelinvasie is een centraal proces in de verspreiding van uitzaaiingen of verre secundaire foci, zoals waargenomen bij GBM-patiënten. Verschillende factoren zijn geïdentificeerd om belangrijk te zijn in GBM invasie zoals trombospondin-1, een transformerende groeifactor bèta (TGFβ-gereguleerd matricellulair eiwit, of de chemokine receptor CXCR3)7,8.

Hier is een vereenvoudigd biomimetisch model beschreven voor het bestuderen van GBM-invasie, waarbij neuronen worden gevormd op sporen van lagmijn en GBM-cellen erop worden gezaaid, als enkele cellen of als sferoïden (Figuur 1B). De twee experimentele instellingen zijn gericht op het samenvatten van invasie op neuronen, die wordt waargenomen in GBM9,10,11. Dergelijke modellen zijn in het verleden ontwikkeld als uitgelijnde nanovezelbiomaterialen (core-shell electrospinning) die het bestuderen van celmigratie mogelijk maken door mechanische of chemische eigenschappen te moduleren12. Het co-cultuurmodel dat in dit artikel wordt beschreven, maakt een beter begrip mogelijk van hoe GBM-cellen ontsnappen op neuronen door nieuwe moleculaire paden te definiëren die bij dit proces betrokken zijn.

Protocol

Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten (van het Haukeland Hospital, Bergen, Noorwegen, volgens de voorschriften van de lokale ethische commissie). Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissies voor menselijke en dierlijke onderzoeksethiek van de Universiteit van Bordeaux. Zwangere ratten werden gehuisvest en behandeld in de dierenfaciliteit van de universiteit van Bordeaux. Euthanasie van een E18-getijde drachtige rat werd uitgevoerd met behulp van CO2. Alle …

Representative Results

Neuronen met patronen die samen met fluorescerende GBM-cellen werden gekweekt, werden voorbereid zoals beschreven in de protocolsectie en er werden trackingexperimenten uitgevoerd. GBM-cellen veranderden snel hun vorm tijdens het migreren op de neuronen (Figuur 1B: paneel 6 en Video 1). Cellen migreerden langs de neuronale extensies, in een willekeurige beweging (Video 1). Fluorescerende GBM-cellen en niet-fluorescerende neuronen kunnen gema…

Discussion

Glioblastomen dringen het parenchym uitgebreid binnen door verschillende modi te gebruiken: co-optie van omliggende bloedvaten, interstitiële invasie of invasie op WMTs18. Deze laatste modus wordt niet goed gekarakteriseerd in de literatuur vanwege de moeilijkheid om geschikte in vitro of in vivo modellen te vinden met betrekking tot WMT-invasie. Hier is een vereenvoudigd model voorgesteld waarin gekweekte knaagdierneuronen werden gevormd op met lag bedekte oppervlakken en fluor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole wordt ondersteund door Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon is een ontvanger van fellowship van het Universitair Ziekenhuis Toulouse (CHU Toulouse).

Materials

(3-aminopropyl) triethoxysilane Sigma 440140-100ML The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate Sarstedt 2582624 Used to prepare spheroids
Accutase Gibco A11105-01 Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides Invitrogen C10283 Used to cell counting
Coverslips Marienfeld 111580 Cell culture substrate
Dessicator cartridges Sigma Z363456-6EA Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm² Falcon 10497302
HBSS Sigma H8264-500ML
Heparin sodium Sigma H3149-100KU Stored at 4 °C
Laminin 114956-81-9 Promotes neuronal adhesion
Leonardo software loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software  Molecular Devices LLC NA Microscopy automation software
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) inverted microscope equipped with a motorized stage 
Penicillin – Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
PLPP Alveole PLPPclassic_1ml Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) Laysan Bio VA-PEG-VA-5000-5g Used as an anti-fouling coating
PRIMO Alveole PRIMO1 Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used for cell counting
Trypsin-EDTA Sigma T4049-100ML Used to detach adherent cells

References

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

Play Video

Cite This Article
Guyon, J., Strale, P., Romero-Garmendia, I., Bikfalvi, A., Studer, V., Daubon, T. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (168), e62213, doi:10.3791/62213 (2021).

View Video