이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양
Summary
여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.
Abstract
교모세포종 (GBM), 학년 IV 악성 교모종, 때문에 그들의 공격적인 특성의 인간 암의 치명적인 유형 중 하나입니다. 이 종양의 유전학에 있는 중요한 어드밴스에 있는 중요한 어드밴스에 도 불구하고, GBM 세포가 건강한 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법 잘 이해되지 않습니다. 특히, GBM 세포가 다른 경로를 통해 회고적 공간을 침범하는 것으로 나타났습니다. 이 논문의 주요 관심사는 백색 물질 지역(WMT)을 따라 가는 경로입니다. 회고신경세포 성분을 가진 종양 세포의 상호 작용은 잘 특징지 않다. 본명, GBM 세포 침략에 대한 뉴런의 영향을 평가하는 방법이 기재되어 있다. 이 논문은 뉴런에 GBM 줄기 와 같은 세포의 이동을 분석하여 WMT 침공을 모방 하는 체외 분석에서 고급 공동 배양 제시. 뉴런이 있는 GBM 셀의 동작은 오픈 소스 및 자유 액세스 소프트웨어와 함께 자동화된 추적 절차를 사용하여 모니터링됩니다. 이 방법은 많은 응용 프로그램에 유용하다, 특히, 기능 및 기계학 연구뿐만 아니라 뉴런에 GBM 세포 이동을 차단 할 수있는 약리학 에이전트의 효과를 분석하기위한.
Introduction
GBM을 포함하여 1 차적인 악성 gliomas는, GBM 환자를 위해 보고된 12 15 달의 중간 생존율로, 치명적인 종양입니다. 현재 치료는 방사선 요법과 결합된 큰 종양 질량 절제술 및 화학요법에 의존합니다, 이는 단지 몇 달까지 생존율을 연장합니다. 치료 실패는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 가난한 약물 전달과 밀접한 관련이 있으며, 경피 공간, 수막 및 WMTs1을따라 침습적인 성장과 관련이 있다. 혈관 공동 선택이라고도 불리는 혈관 침전은 잘 연구된 과정이며 분자 메커니즘이 해명되기 시작했습니다. 그러나, WM을 따라 GBM 세포 침공의 과정은 잘 이해되지 않습니다. 종양 세포는 Scherer의 이차 구조물2를따라 건강한 뇌로 이동합니다. 실제로, 거의 1세기 전, 한스-요아킴 셰러는 GBM의 침략적인 경로를 설명했는데, 이는 현재 복막 사텔리토시스, 각성 사텔리토증, 피증 확산 및 WMT(그림1A)를따라 침략하는 것으로 불린다.
기질 세포 유래 인자-1α(SDF1α) 및 C-X-C 모티프 케모키네 수용체 4(CXCR4)와 같은 일부 체모키네 및 그 수용체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 아닌 WMT 침입3에연루된 것으로 보인다. 최근에는 세포간 NOTCH1-SOX2 축이 GBM 세포4의WMT 침입에 중요한 통로로 나타났다. 저자는 GBM 줄기 같이 세포가 GBM 세포에 의하여 myelinated 신경의 파괴를 건의하는 부분적으로 미켈린 신경에 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법을 설명했습니다. 이정표는 3개의 기사가 자연 저널에 연속적으로 간행될 때 2019년에 도달했습니다, 신경교종 발달에 있는 전기 활동의 역할을밑줄5,6. Monje와 협력자들의 정액 작업은 신경교종 발달을 촉진하는 neuroligin-3의 분비에서 전기 활동의 중심 역할에 빛을 비추습니다.
윙클러와 협력자는 GBM 세포 사이의 연결을 설명 (마이크로 튜브) 침습적 인 단계에서 중요하고, 최근, 새로 설명 된 신경 교종 시냅스를 통해 GBM 세포와 뉴런 사이의 상호 작용. 이러한 구조는 종양 발달과 침입을 촉진하는 GBM 세포막에 위치한 α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이삭사졸프로피오닉산(AMPA) 수용체의 글루타마테게틱 자극을 선호합니다. 종양 세포 침전은 GBM 환자에서 관찰된 바와 같이 전이 또는 먼 이차 포시의 보급에 있는 중앙 과정입니다. 여러 가지 요인이 혈전폰딘-1, 변형성장인자 베타(TGFβ-조절된 수반성 단백질, 또는 체모키네 수용체 CXCR3)7,8과같은 GBM침공에서중요한 것으로 확인되었다.
여기서, 단순화된 생체 mimetic 모델은 GBM 침공을 연구하기 위해 설명되어 왔으며, 여기서 뉴런은 라미닌의 트랙에 패턴화되고, GBM 세포는 단일 세포 또는 스페로이드(도1B)로시드된다. 두 가지 실험 설정은 GBM9,10,11에서관찰되는 뉴런에 대한 침략을 재구성하는 것을 목표로합니다. 이러한 모델은 과거에 기계적 또는 화학적특성을조절하여 세포 이동을 연구할 수 있는 정렬된 나노섬유 생체 재료(코어 쉘 전기방사)로 개발되었다. 이 문서에서 설명 된 공동 배양 모델은 GBM 세포가이 과정에 관련된 새로운 분자 경로를 정의하여 뉴런에서 탈출하는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
교모세포종은 주변 혈관의 공동 옵션, 간질 침입 또는 WMTs18에대한 침략 : 다양한 모드를 사용하여 parenchyma를 광범위하게 침공한다. 이 후자의 모드는 WMT 침공과 관련된 생체 외 또는 생체 내 모델에 적합한 것을 찾는 데 어려움이 있기 때문에 문학에서 잘 특징지 지않습니다. 여기서, 배양된 설치류 뉴런이 라미닌 코팅 표면에 패턴화되고 형광 GBM 줄기와 같은 세포가…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Fondation ARC 2020, 리그 콘트르 르 암 (코미트 드 라 지롱드), ARTC, 계획 암 2021, INCA PLBIO에 의해 지원되었다. 알베올은 에이전시 내셔널 드 라 레체쉬 (그랜트 라벡스 브레인 ANR-10-LABX-43)에 의해 지원됩니다. 조리스 가이온은 툴루즈 대학 병원(추 툴루즈)의 펠로우십 수혜자입니다.
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
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