Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Summary

Aqui, apresentamos um ensaio de cocultura fácil de usar para analisar a migração de glioblastoma (GBM) em neurônios padronizados. Desenvolvemos uma macro no software FiJi para fácil quantificação da migração celular GBM em neurônios, e observamos que os neurônios modificam a capacidade invasiva celular GBM.

Abstract

Glioblastomas (GBMs), gliomas malignos de grau IV, são um dos tipos mais mortais de câncer humano por causa de suas características agressivas. Apesar dos avanços significativos na genética desses tumores, como as células GBM invadem o parenchyma cerebral saudável não é bem compreendida. Notavelmente, foi demonstrado que as células GBM invadem o espaço peritumoral através de diferentes rotas; o principal interesse deste artigo é a rota ao longo de tratos de matéria branca (WMTs). As interações das células tumorais com os componentes das células nervosas peritumorais não são bem caracterizadas. Aqui, foi descrito um método que avalia o impacto dos neurônios na invasão celular GBM. Este artigo apresenta um ensaio avançado de cocultura in vitro que imita a invasão de WMT analisando a migração de células-tronco GBM em neurônios. O comportamento das células GBM na presença de neurônios é monitorado usando um procedimento de rastreamento automatizado com software de código aberto e de acesso livre. Este método é útil para muitas aplicações, em particular, para estudos funcionais e mecanicistas, bem como para analisar os efeitos de agentes farmacológicos que podem bloquear a migração celular GBM em neurônios.

Introduction

Gliomas malignos primários, incluindo GBMs, são tumores devastadores, com uma taxa média de sobrevivência de 12 a 15 meses relatada para pacientes com GBM. A terapia atual conta com grande ressecção de massa tumoral e quimioterapia aliada à radioterapia, que só aumenta a taxa de sobrevivência em poucos meses. As falhas terapêuticas estão intimamente relacionadas ao mau fornecimento de drogas através da barreira hematoencefálica (BBB) e ao crescimento invasivo em espaços perivasculares, meninges e ao longo das OTN¹. A invasão perivascular, também chamada de co-opção vascular, é um processo bem estudado, e os mecanismos moleculares estão começando a ser elucidados; no entanto, o processo de invasão de células GBM ao longo de WMTs não é bem compreendido. As células tumorais migram para o cérebro saudável ao longo das estruturas secundárias de Scherer². De fato, há quase um século, Hans-Joachim Scherer descreveu as rotas invasivas do GBM, que agora são referidas como satellitose perineuronal, satellitose perivascular, propagação subpial e invasão ao longo do WMT (Figura 1A).

Algumas quimiocinas e seus receptores, como o fator de crescimento estroboma derivado de células estromal 1α (SDF1α) e c-X-C, o receptor de quimioterapia 4 (CXCR4), mas não o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), parecem estar implicados na invasão do TNM³. Mais recentemente, um eixo TRANScelular NOTCH1-SOX2 mostrou-se um importante caminho na invasão de WMT de células GBM⁴. Os autores descreveram como células-tronco GBM invadem o parênquim cerebral em neurônios parcialmente nãoomiados, sugerindo a destruição de baias de mielina por células GBM. Um marco foi alcançado em 2019, quando três artigos foram publicados de forma consecutiva na revista Nature, destacando o papel da atividade elétrica no desenvolvimento do glioma^5,6. O trabalho seminal de Monje e colaboradores lançou luz sobre o papel central da atividade elétrica na secreção da neuroligina-3, que promove o desenvolvimento do glioma.

Winkler e colaboradores descreveram as conexões entre as células GBM (microtubos) sendo cruciais em etapas invasivas e, ultimamente, interações entre células GBM e neurônios através de sinapses neuroglioma recém-descritas. Essas estruturas favorecem a estimulação glutamatergica de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA) localizados na membrana celular GBM, que promove o desenvolvimento e invasão do tumor. A invasão de células tumorais é um processo central na disseminação de metástases ou focos secundários distantes, como observado em pacientes com GBM. Vários fatores foram identificados como importantes na invasão do GBM, como o trombospondina-1, um fator de crescimento transformador beta (proteína matricellular regulada por TGFβ, ou o receptor de quimioterapia CXCR3)^7,8.

Aqui, um modelo biomimético simplificado foi descrito para estudar a invasão gbm, em que os neurônios são padronizados em trilhas de laminina, e as células GBM são semeadas sobre ele, como células únicas ou como esferoides(Figura 1B). As duas configurações experimentais visam recapitular a invasão sobre neurônios, o que é observado em GBM^9,10,11. Tais modelos foram desenvolvidos no passado como biomateriais de nanofibra alinhados (eletropinning de conchas centrais) que permitem estudar a migração celular através da modulação de propriedades mecânicas ou químicas¹². O modelo de cocultura descrito neste artigo permite uma melhor compreensão de como as células GBM escapam nos neurônios definindo novas vias moleculares envolvidas nesse processo.

Protocol

O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com os regulamentos do comitê de ética local). Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa humana e animal da Universidade de Bordeaux. Ratos grávidas foram alojados e tratados na instalação animal da Universidade de Bordeaux. A eutanásia de um rato grávida cronometrado E18 foi realizada usando CO2. Todos os procedimentos de animais foram feitos de acordo co…

Representative Results

Neurônios padronizados co-cultivados com células GBM fluorescentes foram preparados como descrito na seção de protocolo, e experimentos de rastreamento foram realizados. As células GBM modificaram rapidamente sua forma enquanto migravam nos neurônios(Figura 1B: painel 6 e vídeo 1). As células migraram ao longo das extensões neuronais, em um movimento aleatório(Vídeo 1). Células GBM fluorescentes e neurônios não fluorescentes po…

Discussion

Glioblastomas invadem extensivamente o parenchyma usando diferentes modos: co-opção de vasos sanguíneos circundantes, invasão intersticiacional ou invasão em WMTs¹⁸. Este último modo não é bem caracterizado na literatura devido à dificuldade em encontrar modelos in vitro ou in vivo adequados relacionados à invasão de WMT. Aqui, foi proposto um modelo simplificado no qual neurônios de roedores cultivados foram padronizados em superfícies revestidas de laminina, e cél…

Materials

(3-aminopropyl) triethoxysilane	Sigma	440140-100ML	The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate	Sarstedt	2582624	Used to prepare spheroids
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides	Invitrogen	C10283	Used to cell counting
Coverslips	Marienfeld	111580	Cell culture substrate
Dessicator cartridges	Sigma	Z363456-6EA	Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm²	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Heparin sodium	Sigma	H3149-100KU	Stored at 4 °C
Laminin		114956-81-9	Promotes neuronal adhesion
Leonardo software			loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software	Molecular Devices LLC	NA	Microscopy automation software
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)			inverted microscope equipped with a motorized stage
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
PLPP	Alveole	PLPPclassic_1ml	Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	Used as an anti-fouling coating
PRIMO	Alveole	PRIMO1	Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used for cell counting
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ML	Used to detach adherent cells