Aislamiento de (micro) ARN fecal
Summary
Este protocolo aísla ARN total de alta calidad de muestras fecales de sujetos animales y humanos. Se utiliza un kit de aislamiento de miARN comercial con una adaptación significativa para aislar ARN puro con cantidad y calidad optimizadas. Los aislados de ARN son buenos para la mayoría de los ensayos de ARN aguas abajo, como la secuenciación, la micromatriz y la RT-PCR.
Abstract
Cada vez está más claro que el ARN existe en la luz intestinal y las heces en animales y humanos. El protocolo descrito a continuación aísla el ARN total, incluidos los microARN, de muestras fecales de sujetos animales y humanos. El objetivo es aislar el ARN total con alta pureza y cantidad para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarray. Las ventajas de este protocolo optimizado en el aislamiento de miARN son la capacidad de aislar productos de ARN altamente purificados con pasos de lavado adicionales descritos, una mayor cantidad de ARN obtenida con un método mejorado en la resuspensión de la muestra y consejos importantes de descontaminación. Una limitación es la incapacidad de procesar y purificar muestras más grandes de más de 200 mg, ya que estos tamaños de muestra causarían una dificultad en la formación clara de la interfase. En consecuencia, el gran tamaño de la muestra puede contaminar la fase acuosa a extraer como se describe en el protocolo con materias orgánicas que afectan la calidad del ARN aislado al final. Sin embargo, los aislados de ARN de una muestra de hasta 200 mg son suficientes para la mayoría de los análisis posteriores.
Introduction
El ARN extracelular está siendo reconocido como un factor significativo que media muchos procesos biológicos1. El ARN extracelular en las heces fue reportado por primera vez en 2008 como un marcador de cáncer de colon y colitis ulcerosa activa2, y recientemente se reveló como un componente normal de la luz intestinal y las heces y media las comunicaciones huésped-microbio 3,4,5. El propósito de este protocolo de aislamiento de ARN es extraer ARN extracelular de alta calidad de muestras fecales recolectadas de sujetos animales y humanos. El protocolo fue adaptado de un kit de aislamiento de miARN comercial. El ARN adquirido se utiliza para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarrays. El protocolo incluye varios consejos importantes y útiles para maximizar la cantidad y calidad del ARN que se encuentra en las heces de animales y humanos. La razón para desarrollar y optimizar este método de aislamiento de ARN (incluido el microARN) es disminuir el ARN microbiano en las heces, limitar las variables en los estudios de investigación y analizar la composición del ARN en el intestino sin tener en cuenta varios factores de confusión y fuentes de contaminación. Cabe destacar que este aislamiento de ARN minimiza la liberación de ARN de células vivas y microbios vivos (ARN celular). Se centra en los ARN extracelulares que han sido liberados por las células intestinales o han sido adquiridos a través de la ingesta de alimentos. Principalmente, este método no es adecuado para estudios donde se investiga el transcriptoma microbiano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es importante utilizar la técnica libre de RNasa para prevenir la contaminación por RNasa durante el aislamiento7. Después de la centrifugación y la formación de una interfase compacta, es clave evitar la interfase, la fase inferior y el contaminante de partículas flotando en la parte superior de la fase acuosa al recuperar la fase acuosa. Además, se agregan dos pasos de lavado con solución de lavado 2/3 de 500 μL y 250 μL para eliminar los contaminantes en la membrana del filtro y optim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recibimos asistencia técnica de la Instalación de Biopolímeros de la Escuela de Medicina de Harvard para el bioanalizador. Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple RG-1707-28516 (H.L.W. y SL).
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
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