糞便(マイクロ)RNA単離
Summary
このプロトコルは、動物およびヒト被験者の糞便サンプルから高品質のトータルRNAを分離します。市販のmiRNA分離キットは、最適化された量と質で純粋なRNAを単離するために、大幅に適応して使用されます。RNA分離株は、シーケンシング、マイクロアレイ、RT-PCRなどのほとんどのダウンストリームRNAアッセイに適しています。
Abstract
RNAは、動物やヒトの腸管腔や糞便に存在することが明らかになりつつあります。以下に説明するプロトコルは、動物およびヒト被験者の糞便サンプルからマイクロRNAを含む全RNAを単離する。目的は、RNAシーケンシング、RT-PCR、マイクロアレイなどのダウンストリーム分析のために、高純度および量のトータルRNAを単離することです。miRNA単離におけるこの最適化されたプロトコルの利点は、説明されている追加の洗浄ステップで高度に精製されたRNA製品を単離する能力、サンプルの再懸濁における改良された方法で得られるRNAの量の増加、および除染の重要なヒントです。1つの制限は、これらのサンプルサイズが間期の明確な形成を困難にするため、200 mgを超えるより大きなサンプルを処理および精製できないことです。その結果、サンプルサイズが大きいと、プロトコルに記載されているように、抽出される水相が、最終的に単離されたRNAの品質に影響を与える有機物で汚染される可能性があります。ただし、ほとんどのダウンストリーム分析には、最大200 mgのサンプルからのRNA分離で十分です。
Introduction
細胞外RNAは、多くの生物学的プロセスを媒介する重要な因子として認識されつつあります1。糞便中の細胞外RNAは、2008年に結腸癌および活動性潰瘍性大腸炎のマーカーとして最初に報告され2、最近、腸管腔および糞便の正常な成分として明らかにされ、宿主と微生物のコミュニケーションを媒介します3,4,5。このRNA分離プロトコルの目的は、動物およびヒトの被験者から収集された糞便サンプルから高品質の細胞外RNAを抽出することです。このプロトコルは、市販のmiRNAアイソレーションキットから採用されました。取得したRNAは、RNAシーケンシング、RT-PCR、マイクロアレイなどのダウンストリーム分析に利用されます。このプロトコルには、動物や人間の糞便に含まれるRNAの量と質を最大化するための重要で有用なヒントがいくつか含まれています。このRNA(マイクロRNAを含む)単離方法を開発および最適化する理由は、糞便中の微生物RNAを減らし、調査研究の変数を制限し、さまざまな交絡因子や汚染源を考慮せずに腸内のRNA組成を分析するためです。注目すべきことに、このRNA単離は、生細胞および生きた微生物からのRNAの放出を最小限に抑えます(細胞RNA)。腸細胞によって放出された、または食物摂取によって獲得された細胞外RNAに焦点を当てています。主に、この方法は微生物トランスクリプトームが調査される研究には適していません。
Protocol
Representative Results
Discussion
分離中のRNase汚染を防ぐために、RNaseフリー技術を使用することが重要です7。遠心分離とコンパクトな間相の形成後、水相を回収するときは、水相、下相、および水相の上部に浮遊する粒子汚染物質を回避することが重要です。さらに、500 μLと250 μLの洗浄液2/3による2つの洗浄ステップが追加され、フィルター膜内の汚染物質を除去して品質を最適化します。さらに、200 mg?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ハーバード大学医学部のバイオポリマー施設からバイオアナライザーの技術支援を受けました。この研究は、全米多発性硬化症学会の研究助成金RG-1707-28516(H.L.W.およびS.L.)によってサポートされました。
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
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