Summary

Выделение фекальной (микро) РНК

Published: October 28, 2020
doi:

Summary

Этот протокол изолирует высококачественную общую РНК из образцов фекалий животных и людей. Коммерческий набор для изоляции миРНК используется со значительной адаптацией для выделения чистой РНК с оптимизированным количеством и качеством. Изоляты РНК хороши для большинства последующих анализов РНК, таких как секвенирование, микромассив и ОТ-ПЦР.

Abstract

Становится ясно, что РНК существует в просвете кишечника и фекалиях у животных и человека. Протокол, описанный ниже, изолирует общую РНК, включая микроРНК, из фекальных образцов животных и людей. Цель состоит в том, чтобы изолировать общую РНК с высокой чистотой и количеством для последующих анализов, таких как секвенирование РНК, ОТ-ПЦР и микромассив. Преимуществами этого оптимизированного протокола при выделении миРНК являются возможности выделения высокоочищенных РНК-продуктов с описанными дополнительными этапами промывки, увеличенное количество РНК, полученной улучшенным методом при повторном суспензии образца, и важные советы по обеззараживанию. Одним из ограничений является невозможность обработки и очистки более крупной выборки более 200 мг, поскольку эти размеры выборки вызовут трудности в четком формировании интерфазы. Следовательно, большой размер выборки может загрязнить водную фазу, подлежащую извлечению, как описано в протоколе, органическими веществами, которые влияют на качество РНК, выделенной в конце. Тем не менее, изоляты РНК из образца до 200 мг достаточны для большинства последующих анализов.

Introduction

Внеклеточная РНК признается значимым фактором, опосредующим многие биологические процессы1. Внеклеточная РНК в кале была впервые зарегистрирована в 2008 году как маркер рака толстой кишки и активного язвенного колита2, и недавно она была выявлена как нормальный компонент просвета кишечника и кала и опосредует связь хозяина с микробом 3,4,5. Целью этого протокола выделения РНК является извлечение высококачественной внеклеточной РНК из образцов фекалий, собранных у животных и людей. Протокол был адаптирован из коммерческого комплекта для изоляции миРНК. Полученная РНК используется для последующего анализа, такого как секвенирование РНК, ОТ-ПЦР и микромассив. Протокол включает в себя несколько важных и полезных советов по максимизации количества и качества РНК, обнаруженных в фекалиях животных и людей. Причиной разработки и оптимизации этого метода выделения РНК (в том числе микроРНК) является снижение микробной РНК в кале, ограничение переменных в научных исследованиях и анализ состава РНК в кишечнике без учета различных смешанных факторов и источников загрязнения. Следует отметить, что эта изоляция РНК минимизирует высвобождение РНК из живых клеток и живых микробов (клеточная РНК). Он фокусируется на внеклеточных РНК, которые были высвобождены клетками кишечника или приобретены при приеме пищи. В принципе, этот метод не подходит для исследований, где исследуется микробный транскриптом.

Protocol

Все методы с участием исследуемых животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Бригама и Женской больницы Гарвардской медицинской школы. Все методы, связанные с человеческими исследованиями, описанн?…

Representative Results

Репрезентативные РНК были выделены из образцов фекалий мышей 50 мг (2 гранулы фекалий мыши) и 100 мг образцов стула человека соответственно и элюированы в воде без нуклеазы объемом 50 мкл. Спектрофотометрический анализ концентрации позволяет выделить общее количество 49 мкг и 16 мкг РНК соот…

Discussion

Важно использовать технику без РНКазы для предотвращения загрязнения РНКазы во время изоляции7. После центрифугирования и образования компактной интерфазы важно избегать межфазной, нижней фазы и загрязняющего вещества частиц, плавающего на вершине водной фазы при восст?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы получили техническую помощь от Центра биополимеров в Гарвардской медицинской школе для биоанализатора. Эта работа была поддержана исследовательским грантом Национального общества рассеянного склероза RG-1707-28516 (H.L.W. и S.L.).

Materials

Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Thermo Fischer Scientific AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fischer Scientific AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) Thermo Fischer Scientific AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer QIAGEN 13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fischer Scientific AM9780
Vortex Shaker

References

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
  9. Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn’s disease biomarkers. Crohn’s & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
  10. Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
  12. Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
  13. Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
  14. Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
  15. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).

Play Video

Cite This Article
Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. Fecal (micro) RNA Isolation. J. Vis. Exp. (164), e61908, doi:10.3791/61908 (2020).

View Video