Summary

צואה (מיקרו) בידוד RNA

Published: October 28, 2020
doi:

Summary

פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

Abstract

זה הולך ומתברר כי RNA קיים לומן המעיים וצואה בבעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול המתואר להלן מבודד את סך הרנ”א כולל מיקרו-רנ”א מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. המטרה היא לבודד RNA כולל עם טוהר וכמות גבוהים עבור ניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. היתרונות של פרוטוקול אופטימלי זה בבידוד miRNA הם היכולות של בידוד מוצרי RNA מטוהרים מאוד עם שלבי שטיפה נוספים שתוארו, כמות מוגברת של RNA המתקבלת בשיטה משופרת בחידוש הדגימה, וטיפים חשובים של פירוק. מגבלה אחת היא חוסר היכולת לעבד ולטהר מדגם גדול יותר של יותר מ -200 מ”ג מכיוון שגודלי דגימה אלה יגרמו לקושי בהיווצרות ברורה של האינטרפאזה. כתוצאה מכך, גודל המדגם הגדול עלול לזהם את הפאזה המימית שיש לחלץ כמתואר בפרוטוקול עם עניינים אורגניים המשפיעים על איכות הרנ”א המבודד בסופו של דבר. עם זאת, רנ”א מבודד מדגימה של עד 200 מ”ג מספיק לרוב הניתוחים במורד הזרם.

Introduction

רנ”א חוץ-תאי מקבל הכרה כגורם משמעותי המתווך תהליכים ביולוגיים רבים1. RNA חוץ-תאי בצואה דווח לראשונה בשנת 2008 כסמן לסרטן המעי הגס ולקוליטיס כיבית פעילה2, והוא התגלה לאחרונה כמרכיב נורמלי של לומן המעיים והצואה ומתווך תקשורת בין חיידקים מארחים 3,4,5. מטרת פרוטוקול בידוד RNA זה היא לחלץ RNA חוץ-תאי באיכות גבוהה מדגימות צואה שנאספו מנבדקים בעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול הותאם מתוך ערכת בידוד miRNA מסחרית. הרנ”א הנרכש מנוצל לניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. הפרוטוקול כולל מספר טיפים חשובים ושימושיים כדי למקסם את הכמות והאיכות של RNA שנמצא בצואה של בעלי חיים ובני אדם. הסיבה לפתח ולייעל שיטה זו של בידוד RNA (כולל מיקרו-רנ”א) היא להקטין את הרנ”א המיקרוביאלי בצואה, להגביל את המשתנים במחקרים ולנתח את הרכב הרנ”א במעיים מבלי לקחת בחשבון גורמים מבלבלים שונים ומקורות זיהום. יש לציין שבידוד רנ”א זה ממזער את שחרור הרנ”א מתא חי וממיקרובים חיים (רנ”א תאי). הוא מתמקד ב-RNA חוץ-תאי ששוחררו על-ידי תאי מעיים או נרכשו באמצעות צריכת מזון. בעיקרון, שיטה זו אינה מתאימה למחקרים שבהם נחקר התעתיק המיקרוביאלי.

Protocol

כל השיטות המערבות חיות מחקר המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים בריגהם אנד נשים, בית הספר לרפואה של הרווארד. כל השיטות המערבות את נושאי המחקר בבני אדם המתוארות כאן הן בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת המחקר האנושית של השותפים.</…

Representative Results

רנ”א מייצגים בודדו מדגימות של 50 מ”ג צואת עכברים (2 כדורי צואה של עכברים) ו-100 מ”ג של דגימות צואה אנושית בהתאמה, ונלקחו במים נטולי נוקלאז של 50 μL. מניתוח ספקטרופוטומטר של הריכוז עולה כי כמות כוללת של 49 מיקרוגרם ו-16 מיקרוגרם RNA בודדו בהתאמה (טבלה 1). טוהר הרנ”א היה גבוה כפי שצוין על ידי יחס A2…

Discussion

חשוב להשתמש בטכניקה נטולת RNase כדי למנוע זיהום RNase במהלך הבידוד7. לאחר צנטריפוגה והיווצרות אינטרפאזה קומפקטית, חשוב להימנע מהאינטרפאזה, הפאזה התחתונה ומזיהום החלקיקים המרחף על החלק העליון של הפאזה המימית בעת שחזור הפאזה המיימית. בנוסף, מתווספים שני שלבי שטיפה עם 500 μL ו- 250 μL Wash S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

קיבלנו סיוע טכני ממתקן הביופולימרים בבית הספר לרפואה של הרווארד לביואנליזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר של האגודה הלאומית לטרשת נפוצה RG-1707-28516 (H.L.W. ו- S.L.).

Materials

Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Thermo Fischer Scientific AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fischer Scientific AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) Thermo Fischer Scientific AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer QIAGEN 13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fischer Scientific AM9780
Vortex Shaker

References

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
  9. Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn’s disease biomarkers. Crohn’s & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
  10. Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
  12. Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
  13. Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
  14. Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
  15. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).

Play Video

Cite This Article
Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. Fecal (micro) RNA Isolation. J. Vis. Exp. (164), e61908, doi:10.3791/61908 (2020).

View Video