Summary

Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

Published: October 28, 2020
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Summary

Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Abstract

Es wird deutlich, dass RNA im Darmlumen und Kot von Tieren und Menschen existiert. Das unten beschriebene Protokoll isoliert die Gesamt-RNA einschließlich microRNAs aus Stuhlproben von Tieren und Menschen. Ziel ist es, Gesamt-RNA mit hoher Reinheit und Menge für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array zu isolieren. Die Vorteile dieses optimierten Protokolls in der miRNA-Isolierung sind die Fähigkeit, hochgereinigte RNA-Produkte mit zusätzlichen beschriebenen Waschschritten zu isolieren, eine erhöhte Menge an RNA, die mit einer verbesserten Methode bei der Resuspension der Probe erhalten wird, und wichtige Tipps zur Dekontamination. Eine Einschränkung ist die Unfähigkeit, größere Proben von mehr als 200 mg zu verarbeiten und zu reinigen, da diese Probengrößen eine Schwierigkeit bei der klaren Bildung der Interphase verursachen würden. Folglich kann die große Probengröße die zu extrahierende wässrige Phase wie im Protokoll beschrieben mit organischen Stoffen kontaminieren, die die Qualität der am Ende isolierten RNA beeinträchtigen. Für die meisten nachgeschalteten Analysen reichen jedoch RNA-Isolate aus einer Probe von bis zu 200 mg aus.

Introduction

Extrazelluläre RNA wird als ein bedeutender Faktor erkannt, der viele biologische Prozesse vermittelt1. Extrazelluläre RNA im Kot wurde erstmals 2008 als Marker für Darmkrebs und aktive Colitis ulcerosa2 berichtet und kürzlich als normaler Bestandteil des Darmlumens und -kots nachgewiesen und vermittelt die Wirt-Mikroben-Kommunikation 3,4,5. Der Zweck dieses RNA-Isolationsprotokolls ist es, qualitativ hochwertige extrazelluläre RNA aus Stuhlproben von Tieren und Menschen zu extrahieren. Das Protokoll wurde von einem kommerziellen miRNA Isolation Kit adaptiert. Die gewonnene RNA wird für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array verwendet. Das Protokoll enthält mehrere wichtige und nützliche Tipps, um die Menge und Qualität der RNA im Kot von Tieren und Menschen zu maximieren. Der Grund für die Entwicklung und Optimierung dieser Methode der RNA-Isolierung (einschließlich microRNA) besteht darin, die mikrobielle RNA im Kot zu verringern, die Variablen in den Forschungsstudien zu begrenzen und die RNA-Zusammensetzung im Darm zu analysieren, ohne verschiedene Störfaktoren und Kontaminationsquellen zu berücksichtigen. Bemerkenswert ist, dass diese RNA-Isolierung die Freisetzung von RNA aus lebenden Zellen und lebenden Mikroben (zelluläre RNA) minimiert. Es konzentriert sich auf extrazelluläre RNAs, die von Darmzellen freigesetzt oder über die Nahrung aufgenommen wurden. Grundsätzlich ist diese Methode nicht für Studien geeignet, bei denen das mikrobielle Transkriptom untersucht wird.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden mit Versuchstieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women’s Hospital der Harvard Medical School genehmigt. Alle hier beschriebenen Methoden mit Humanforschungssubjekten entsprechen den Richtlinien des Partners Human Research Committee. 1. Entnahme von Kotproben Autoklav oder Vorbereitung eines sterilen und nukleasefreien 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit Schraubverschluss für…

Representative Results

Repräsentative RNAs wurden aus 50 mg Mauskotproben (2 Mauskotpellets) bzw. 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert und in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert. Die Spektralphotometeranalyse der Konzentration legt nahe, dass insgesamt 49 μg bzw. 16 μg RNA isoliert wurden (Tabelle 1). Die RNA-Reinheit war hoch, was durch ein A260/A280-Verhältnis von ~2,0 und ein A260/A230-Verhältnis von ~1,8 angezeigt wird (Tabelle 1). Wie berichtet3, ist die Mehrheit der RNAs…

Discussion

Es ist wichtig, eine RNase-freie Technik zu verwenden, um eine RNase-Kontamination während der Isolierung zu verhindern7. Nach der Zentrifugation und der Bildung einer kompakten Interphase ist es wichtig, zu vermeiden, dass die Interphase, die untere Phase und die Partikelverunreinigung auf der Oberseite der wässrigen Phase schwimmen, wenn die wässrige Phase zurückgewonnen wird. Zusätzlich werden zwei Waschschritte mit 500 μL und 250 μL Waschlösung 2/3 hinzugefügt, um Verunreinigungen in …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir erhielten technische Unterstützung von der Biopolymers Facility der Harvard Medical School für Bioanalysatoren. Diese Arbeit wurde durch das Forschungsstipendium der National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. und S.L.) unterstützt.

Materials

Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Thermo Fischer Scientific AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fischer Scientific AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) Thermo Fischer Scientific AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer QIAGEN 13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fischer Scientific AM9780
Vortex Shaker

References

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
  9. Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn’s disease biomarkers. Crohn’s & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
  10. Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
  12. Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
  13. Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
  14. Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
  15. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).

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Cite This Article
Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. Fecal (micro) RNA Isolation. J. Vis. Exp. (164), e61908, doi:10.3791/61908 (2020).

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