İnsan primer akut miyeloid lösemi (AML) örneklerinde NKG2D ligand (NKG2DL) tespiti için iki farklı boyama protokolü sunuyoruz. İlk yaklaşım, bilinen ve potansiyel olarak henüz bilinmeyen tüm ligandları tanıyabilen bir füzyon proteinine dayanırken, ikinci protokol birden fazla anti-NKG2DL antikorunun eklenmesine dayanır.
Aynı hastada, NKG2D ligandlarının (NKG2DL) yüzey ekspresyonunun yokluğunun, benzer lösemi spesifik genetik mutasyonlar taşımalarına rağmen hastalık başlatma potansiyeli olmayan daha farklılaştırılmış muadil lösemi hücrelerinden kök hücre özelliklerine (lökemik kök hücreler, LSC’ler olarak adlandırılır) sahip lösemik subpopulasyonları ayırt ettiği gösterilmiştir. NKG2DL biyokimyasal olarak çok çeşitli MHC sınıfı I benzeri öz moleküllerdir. Homeostatik koşullardaki sağlıklı hücreler genellikle hücre yüzeyinde NKG2DL’i ifade etmez. Bunun yerine, bu ligandların ekspresyasyonu, doğal öldürücü (NK) hücreler gibi NKG2D reseptör ifade eden bağışıklık hücreleri aracılığıyla lizis yoluyla hasarlı hücrelerin ortadan kaldırılmasını tetiklemek için hücresel strese (örneğin onkojenik dönüşüm veya enfeksiyöz uyaranlar) maruz kalma üzerine indüklenmiştir. İlginçtir ki, NKG2DL yüzey ekspresyözü LSC alt nüfuslarında seçici olarak bastırılır ve bu hücrelerin NKG2D aracılı bağışıklık gözetiminden kaçınmasına izin verir. Burada, kanser hücreleri üzerinde NKG2DL yüzey ekspresyonunun araştırılmasına izin veren iki farklı akış sitometri yönteminin yan yana analizini sunuyoruz, yani pan-ligand tanımayı içeren bir yöntem ve tek ligandlara karşı birden fazla antikor ile boyama içeren bir yöntem. Bu yöntemler, putatif kanser kök hücre özelliklerine sahip canlı NKG2DL negatif hücresel alt nüfusları NKG2DL pozitif LSC olmayanlardan ayırmak için kullanılabilir.
NK hücreleri, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kötü huylu hücreleri veya stresli sağlıklı hücreleri (örneğin, viral bir enfeksiyonla) önceden antijen stimülasyonu olmadan tanıyabilen ve ortadan kaldırabilen önemli etkileridir1. Bu işlem, doğal sitotoksisite reseptörleri (NCR), NKG2D ve CD16 gibi aktif reseptörler ve büyük ölçüde öldürücü immünoglobulin benzeri reseptörler (KIR)2ile temsil edilen inhibitör reseptörleri ile sıkı bir şekilde düzenlenir. KIR’lerin somatik hücreler üzerinde insan lökosit antijen (HLA) sınıfı I moleküllerine bağlanması, kendini tanımayı sağlar ve NK hücre toleransını iletir. Öte yandan, kendini tanımanın olmaması ve reseptörlerin hedef hücrelerdeki ligandlarına aktive etmenin artan bağlanması, NK hücre aracılı sitotoksikliğe yol açan sitotoksik granüllerin salınımını tetikler1. Son olarak, NK hücreleri, aktive edici reseptör CD16’yı Ig (FcR)2’ninFc kısmını ifade eden hedeflere bağlayarak antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik (ADCC) uygulayabilir. Doğrudan sitotoksikliğin yanı sıra, NK hücreleri de doğuştan gelenleri adaptif bağışıklık sistemi ile köprüleyen sitokin salınımını tetikleyebilir3.
NKG2D, NK, NKT, φδ T ve naif CD8+ T hücreleri4’te ifade edilen ve bu tür sitotoksik bağışıklık hücrelerinin hedef hücreleri ifade eden NKG2D ligand ‘ı (NKG2DL) tanımasını ve 2.zıdamasını sağlayan önemli bir aktive edici reseptördür. Sağlıklı hücreler genellikle NKG2DL’i ifade etmez. Bunun yerine, NKG2DL ekspresyözü kötü huylu veya virüs bulaşmış hücrelerde, bunları bağışıklık açıklığı5’euygun hale getirmek için yükseltilir.
İnsan NKG2DL ailesi, aralarında MHC I zincirine bağlı iki molekül A ve B (MICA ve MICB6)ve sitomegalovirüs UL16 bağlayıcı proteinlerin 1–6 (ULBP1-67)bulunduğu bilinen sekiz molekülden oluşur. NKG2DL’nin ifadesi transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri sonrası düzeyler üzerinde düzenlenir8. Bu nedenle sağlıklı dokularda NKG2DL ekspresyözü sağlıklı hücrelerin yüzeyinde yaygın olarak saptanamazken, NKG2DL mRNA9 ve hücre içi protein ekspresyözü bildirilmiştir. Bu tür ifadenin işlevsel ilgisi ve bu tür gizli ifade desenlerinin altında kalan mekanizmalar tanımlanmaya devam eder10.
Kanser hücrelerinde NKG2DL ekspresyonunun mekanistik düzenlemesi büyüleyici bir araştırma alanıdır. Hücresel streste yer aldığı bilinen yollar, örneğin ısı şoku stres yolu9veya ATAKSI TELANGIEKTEKTAZI mutasyona uğramış (ATM) ve Rad3 ile ilgili (ATR) yol11gibi DNA hasarı ile ilişkili yollar ve viral veya bakteriyel enfeksiyonlar doğrudan NKG2DL ekspresyonunun indüksiyonu ile bağlantılıdır12. Bununla birlikte, NKG2DL’nin yüzey ekspresyonu etkili bir şekilde indüklenmiş olsa bile, bu ifade, bazı kanserlerde bağışıklık kaçışı ve zayıf klinik prognoz ile ilişkili bir mekanizma olan proteolitik aracılı dökülme yoluyla tekrar kaybolabilir13.
Hücre yüzeyi NKG2DL’nin yokluğu da AML’li hastalarda önemli roller oynayabilir. Burada, yoğun kemoterapi ile tedavi genellikle remisyona neden olur, ancak nüks genellikle kemoterapilerden seçici olarak kurtulan ve bağışıklık tepkisinden kaçan lösemik kök hücrelerden (LSC) ortaya çıkar. Son zamanlarda gösterdiğimiz gibi, LSC’ler, örneğin, NKG2DL yüzey ifadesini bastırarak NK hücre lizizinden kaçar14.
Tersine, yüzey NKG2DL ekspresyonunun yokluğu, hücrelerin putatif kök benzeri alt nüfuslarını toplu muadil lösemik alt nüfuslardan tanımlamak ve canlı bir şekilde izole etmek için bir yöntem olarak kullanılabilir. Burada, NKG2DL yüzey ekspresyonünü tespit etmek ve böylece lösemide ve belki de diğer kanserlerde NKG2DL negatif kök hücrelerini tanımlamak için kullanılabilecek iki akış sitometrik yaklaşımı sunuyoruz: Pan-ligand yüzey tanıma için bir yöntem ve bilinen NKG2DL proteinlerini tanıyan tek veya havuzlu antikorlarla boyama içeren bir yöntem.
Burada, insan birincil AML hücrelerinde NKG2DL yüzey ekspresyonünü tespit edebilecek iki akış sitometrik yöntemi sunuyoruz. Her iki algılama yönteminin de diğer antikor lekeleri ile birlikte kullanılabileceğini gösteriyoruz (örneğin CD34 ekspresyonun algılanmasını). Benzer boyamalar diğer birincil hücre tiplerinde ve hücre hatlarında da yapılabilir.
Son zamanlarda AML hasta patlamalarının yüzeyinde NKG2DL’nin bulunmamasının LSC14’izenginleşt…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (179239), Kanserle Mücadele Vakfı (Zuerich), Wilhelm Sander Vakfı’ndan CL’ye (2019.042.1) ve Novartis Tıbbi-Biyolojik Araştırma Vakfı’ndan C.L.’ye verilen hibelerle desteklendi. Ayrıca, bu proje 765104 Numaralı Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır. Basel’deki Flow Cytometry Tesisi’ne destek için teşekkür ederiz.
7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |