Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta
Summary
Presentiamo due diversi protocolli di colorazione per il rilevamento del ligando NKG2D (NKG2DL) nei campioni di leucemia mieloide acuta primaria umana (AML). Il primo approccio si basa su una proteina di fusione, in grado di riconoscere tutti i ligandi noti e potenzialmente ancora sconosciuti, mentre il secondo protocollo si basa sull’aggiunta di anticorpi anti-NKG2DL multipli.
Abstract
All’interno dello stesso paziente, l’assenza di espressione superficiale dei ligandi NKG2D (NKG2DL) ha dimostrato di distinguere le sottopopolazioni leucemiche con proprietà delle cellule staminali (le cosiddette cellule staminali leucemiche, LSC) da cellule leucemiche di controparte più differenziate che mancano di potenziale di iniziazione della malattia sebbene portino mutazioni genetiche specifiche della leucemia simili. Gli NKG2DL sono auto-molecole simili a MHC di classe I, biochimicamente molto diverse. Le cellule sane in condizioni omeostatiche generalmente non esprimono NKG2DL sulla superficie cellulare. Invece, l’espressione di questi ligandi è indotta dall’esposizione allo stress cellulare (ad esempio, trasformazione oncogenica o stimoli infettivi) per innescare l’eliminazione delle cellule danneggiate attraverso lalisi attraverso cellule immunitarie che esprimono il recettore NKG2D come le cellule natural killer (NK). È interessante notare che l’espressione superficiale di NKG2DL viene soppressa selettivamente nelle sottopopolazioni LSC, consentendo a queste cellule di eludere la sorveglianza immunitaria mediata da NKG2D. Qui, presentiamo un’analisi affiancata di due diversi metodi di citometria a flusso che consentono lo studio dell’espressione superficiale di NKG2DL sulle cellule tumorali, cioè un metodo che prevede il riconoscimento del pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi multipli contro singoli ligandi. Questi metodi possono essere utilizzati per separare le sottopopolazioni cellulari negative NKG2DL vitali con proprietà putative delle cellule staminali tumorali dal NKG2DL positivo non LSC.
Introduction
Le cellule NK sono importanti effettori del sistema immunitario innato in grado di riconoscere ed eliminare le cellule maligne o le cellule sane stressate (ad esempio, da un’infezione virale) senza previo stimolo dell’antigene1. Questo processo è strettamente regolato attraverso un complesso repertorio di recettori attivanti – come recettori naturali della citotossicità (NCR), NKG2D e CD16 – e recettori inibitori che sono in gran parte rappresentati da recettori killer simili a immunoglobuline (KIR)2. Il legame dei KIR con le molecole umane di antigene leucocitare (HLA) di classe I su cellule somatiche garantisce l’auto-riconoscimento e trasmette la tolleranza cellulare NK. D’altra parte, l’assenza di auto-riconoscimento e l’aumento del legame dei recettori attivanti ai loro ligandi sulle cellule bersaglio innescano il rilascio di granuli citotossici che portano alla citotossicità mediata dalle cellule NK1. Infine, le cellule NK possono esercitare citotossicità cellulare dipendente dagli anticorpi (ADCC) legando il recettore di attivazione CD16 a bersagli che esprimono la porzione Fc di Ig (FcR)2. Oltre alla citotossicità diretta, le cellule NK possono anche innescare il rilascio di citochine che collega l’innato con il sistema immunitario adattivo3.
NKG2D è un importante recettore attivante espresso su cellule NK, NKT, γδ T e INgenua CD8+ T4 che consente a tali cellule immunitarie citotossiche di riconoscere e lisciviare il ligando NKG2D (NKG2DL) che esprime le cellule bersaglio. Le cellule sane comunemente non esprimono NKG2DL. Invece, l’espressione NKG2DL è upregolata su cellule maligne o infettate da virus per renderle suscettibili al nulla osta immunitario5.
La famiglia umana NKG2DL comprende otto molecole conosciute tra cui le due molecole A e B correlate alla catena MHC I (MICA e MICB6)e le proteine leganti ul16 del citomegalovirus 1-6 (ULBP1-67). L’espressione di NKG2DL è regolata sui livelli trascrizionale, post-trascrizionale e post-traslazione8. Come tale, mentre l’espressione NKG2DL non è comunemente rilevabile sulla superficie di cellule sane, NKG2DL mRNA9 ed espressione proteica intracellulare sono stati riportati nei tessuti sani. La rilevanza funzionale di tale espressione e i meccanismi alla base di tali modelli di espressione discrepant devono ancora esseredefiniti 10.
La regolazione meccanicistica dell’espressione NKG2DL nelle cellule tumorali è un’affascinante area di indagine. Le vie note per essere coinvolte nello stress cellulare, ad esempio la via di stress da shocktermico 9,o le vie associate al danno al DNA, come l’atassia telangiectasia mutata (ATM) e la via11correlata a Rad3 (ATR), così come le infezioni virali o batteriche sono state direttamente collegate all’induzione dell’espressione NKG2DL12. Tuttavia, anche se l’espressione superficiale di NKG2DL è stata efficacemente indotta, questa espressione può essere persa di nuovo attraverso lo spargimento mediato proteoliticamente, un meccanismo associato alla fuga immunitaria e alla scarsa prognosi clinica in alcuni tumori13.
L’assenza di superficie cellulare NKG2DL può anche svolgere ruoli importanti nei pazienti con AML. Qui, il trattamento con chemioterapia intensiva spesso induce remissione, ma la ricaduta si verifica spesso da cellule staminali leucemiche (LSC), che sopravvivono selettivamente alle chemioterapie ed eludono la risposta immunitaria. Come abbiamo dimostrato di recente, gli LSC, ad esempio, sfuggono alla lisi cellulare NK sopprimendo l’espressione di superficie NKG2DL14.
Inversamente, l’assenza di espressione di NKG2DL superficiale può essere utilizzata come metodo per identificare e isolare vibilmente sottopopolazioni putative simili a staminali di cellule dalle sottopopolazioni leucemiche di controparte sfusa. Qui, presentiamo due approcci citometrici a flusso che possono essere utilizzati per rilevare l’espressione superficiale NKG2DL e quindi identificare le cellule staminali negative NKG2DL nella leucemia e forse anche in altri tumori: un metodo per il riconoscimento della superficie pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi singoli o raggruppati che riconoscono singole proteine NKG2DL conosciute.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui presentiamo due metodi citometrici a flusso in grado di rilevare l’espressione di superficie NKG2DL sulle cellule AML primarie umane. Mostriamo che entrambi i metodi di rilevamento possono essere utilizzati in combinazione con altre colorazioni anticorpali (ad esempio, rilevando l’espressione CD34). Colorazioni simili possono essere eseguite anche su altri tipi di cellule primarie e linee cellulari.
Di recente abbiamo dimostrato che l’assenza di NKG2DL sulla superficie delle esplosioni del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzera per la scienza (179239), della Fondazione per la lotta contro il cancro (Zuerich), della Fondazione Wilhelm Sander a CL (2019.042.1) e della Fondazione Novartis per la ricerca medico-biologica a C.L. Inoltre, questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 765104. Ringraziamo il Flow Cytometry Facility di Basilea per il supporto.
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
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