Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie
Summary
Wir präsentieren zwei verschiedene Färbeprotokolle für den Nachweis von NKG2D-Liganden (NKG2DL) in Humanproben mit primärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Der erste Ansatz basiert auf einem Fusionsprotein, das in der Lage ist, alle bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden zu erkennen, während das zweite Protokoll auf der Zugabe mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper beruht.
Abstract
Innerhalb desselben Patienten wurde gezeigt, dass das Fehlen einer Oberflächenexpression von NKG2D-Liganden (NKG2DL) leukämische Subpopulationen mit Stammzelleigenschaften (sogenannte leukämische Stammzellen, LSCs) von differenzierteren leukämischen Gegenstückzellen unterscheidet, denen das Krankheitsinitiierungspotenzial fehlt, obwohl sie ähnliche leukämiespezifische genetische Mutationen aufweisen. NKG2DL sind biochemisch sehr vielfältige MHC-Klasse-I-ähnliche Selbstmoleküle. Gesunde Zellen unter homöostatischen Zuständen exprimieren im Allgemeinen kein NKG2DL auf der Zelloberfläche. Stattdessen wird die Expression dieser Liganden bei Exposition gegenüber zellulärem Stress (z. B. onkogene Transformation oder infektiöse Reize) induziert, um die Eliminierung geschädigter Zellen durch Lyse durch NKG2D-Rezeptor-exprimierende Immunzellen wie natürliche Killerzellen (NK) auszulösen. Interessanterweise wird die NKG2DL-Oberflächenexpression in LSC-Subpopulationen selektiv unterdrückt, so dass diese Zellen der NKG2D-vermittelten Immunüberwachung entgehen können. Hier präsentieren wir eine Parallelanalyse von zwei verschiedenen Durchflusszytometrie-Methoden, die die Untersuchung der NKG2DL-Oberflächenexpression auf Krebszellen ermöglichen, d.h. eine Methode mit Panligandenerkennung und eine Methode, bei der mit mehreren Antikörpern gegen einzelne Liganden gefärbt wird. Diese Methoden können verwendet werden, um lebensfähige NKG2DL-negative zelluläre Subpopulationen mit mutmaßlichen Krebsstammzelleigenschaften von NKG2DL-positiven Nicht-LSC-Eigenschaften zu trennen.
Introduction
NK-Zellen sind wichtige Effektoren des angeborenen Immunsystems, die bösartige Zellen oder gestresste gesunde Zellen (z.B. durch eine Virusinfektion) ohne vorherige Antigenstimulation erkennen und eliminieren können1. Dieser Prozess wird durch ein komplexes Repertoire an aktivierenden Rezeptoren – wie natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren (NCRs), NKG2D und CD16 – und inhibitorische Rezeptoren, die weitgehend durch Killer-Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren (KIRs) repräsentiert werden, streng reguliert2. Die Bindung von KIRs an humane Leukozytenantigen (HLA)-Klasse-I-Moleküle auf somatischen Zellen gewährleistet die Selbsterkennung und vermittelt NK-Zelltoleranz. Auf der anderen Seite lösen das Fehlen von Selbsterkennung und die erhöhte Bindung von aktivierenden Rezeptoren an ihre Liganden auf den Zielzellen die Freisetzung von zytotoxischen Granula aus, die zu einer NK-zellvermittelten Zytotoxizität führen1. Schließlich können NK-Zellen eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ausüben, indem sie den aktivierenden Rezeptor CD16 an Ziele binden, die den Fc-Anteil von Ig (FcR)2exprimieren. Neben der direkten Zytotoxizität können NK-Zellen auch die Zytokinfreisetzung auslösen, die das Angeborene mit dem adaptiven Immunsystem überbrückt3.
NKG2D ist ein wichtiger aktivierender Rezeptor, der auf NK-, NKT-, γδ T- und naiven CD8+ T-Zellen4 exprimiert wird und es solchen zytotoxischen Immunzellen ermöglicht, NKG2D-Liganden (NKG2DL) exprimierende Zielzellen zu erkennen und zu lysieren. Gesunde Zellen exprimieren normalerweise kein NKG2DL. Stattdessen wird die NKG2DL-Expression auf bösartigen oder virusinfizierten Zellen hochreguliert, um diese für die Immunclearance 5 zuverbessern.
Die humane NKG2DL-Familie umfasst acht bekannte Moleküle, darunter die beiden MHC-I-Kettenmoleküle A und B (MICA und MICB6)und die Cytomegalievirus UL16-bindenden Proteine 1–6 (ULBP1-67). Die Expression von NKG2DL wird auf der transkriptionellen, posttranskriptionellen sowie post-translationalen Ebene8reguliert. Während die NKG2DL-Expression auf der Oberfläche gesunder Zellen normalerweise nicht nachweisbar ist, wurden NKG2DL mRNA9 und intrazelluläre Proteinexpression in gesunden Geweben berichtet. Die funktionelle Relevanz eines solchen Ausdrucks und die Mechanismen, die solchen abweichenden Ausdrucksmustern zugrunde liegen, müssen noch definiert werden10.
Die mechanistische Regulation der NKG2DL-Expression in den Krebszellen ist ein faszinierendes Untersuchungsgebiet. Signalwege, von denen bekannt ist, dass sie entweder an zellulärem Stress beteiligt sind, z. B. der Hitzeschockstressweg9,oder DNA-schadensbedingte Signalwege, wie der Ataxie-Teleangiektasie-mutierte (ATM) und Rad3-assoziierte (ATR) Weg11,sowie virale oder bakterielle Infektionen wurden direkt mit der Induktion der NKG2DL-Expression12in Verbindung gebracht. Aber selbst wenn die Oberflächenexpression von NKG2DL effektiv induziert wurde, kann diese Expression durch proteolytisch vermittelte Ausscheidung wieder verloren gehen, ein Mechanismus, der bei einigen Krebsarten mit Immunentwehung und schlechter klinischer Prognose verbunden ist13.
Das Fehlen von Zelloberflächen-NKG2DL kann auch bei Patienten mit AML eine wichtige Rolle spielen. Hier induziert die Behandlung mit intensiver Chemotherapie oft eine Remission, aber ein Rückfall tritt häufig aus leukämischen Stammzellen (LSC) auf, die Chemotherapien selektiv überleben und der Immunantwort entgehen. Wie wir kürzlich gezeigt haben, entgehen LSCs beispielsweise der NK-Zelllyse, indem sie die NKG2DL-Oberflächenexpression14unterdrücken.
Umgekehrt kann das Fehlen einer Oberflächen-NKG2DL-Expression als Methode verwendet werden, um mutmaßliche stammähnliche Subpopulationen von Zellen aus leukämischen Subpopulationen zu identifizieren und kämisch zu isolieren. Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Ansätze vor, mit denen die NKG2DL-Oberflächenexpression nachgewiesen und damit NKG2DL-negative Stammzellen bei Leukämie und vielleicht auch bei anderen Krebsarten identifiziert werden können: Eine Methode zur Panliganden-Oberflächenerkennung und eine Methode zur Färbung mit einzelnen oder gepoolten Antikörpern, die einzelne bekannte NKG2DL-Proteine erkennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Methoden vor, die die NKG2DL-Oberflächenexpression auf menschlichen primären AML-Zellen nachweisen können. Wir zeigen, dass beide Nachweismethoden in Verbindung mit anderen Antikörperfärbungen (z.B. Nachweis der CD34-Expression) eingesetzt werden können. Ähnliche Färbungen können auch an anderen primären Zelltypen und Zelllinien durchgeführt werden.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass das Fehlen von NKG2DL auf der Oberfläche von AML-Patie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Schweizerischen Nationalfonds (179239), der Stiftung zur Krebsbekämpfung (Zürich), der Wilhelm Sander Stiftung an CL (2019.042.1) und der Novartis Stiftung für medizinisch-biologische Forschung an C.L. Darüber hinaus wurde dieses Projekt aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 765104 gefördert. Wir danken der Durchflusszytometrie-Anlage in Basel für die Unterstützung.
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
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