NKG2D 利甘德表面检测的两种流细胞学方法，以区分干细胞与急性骨髓性白血病中的散装亚群
Summary
我们在人类原发性急性骨髓性白血病 （AML） 样本中提出了 NKG2D 配体 （NKG2DL） 检测的两种不同的染色方案。第一种方法基于融合蛋白，能够识别所有已知和潜在的未知配体，而第二种方法依赖于添加多个抗NKG2DL抗体。
Abstract
在同一患者中，NKG2D配体（NKG2DL）表面表达的缺失被证明能够区分具有干细胞特性的白血病亚群（所谓的白血病干细胞，LSC）和更差异化的对应白血病细胞，这些白血病细胞虽然携带类似的白血病特异性基因突变，但缺乏疾病启动潜力。NKG2DL 是生化高度多样化的 MHC 类 I 类自分子。在家居静止条件下的健康细胞通常不会在细胞表面表达 NKG2DL。相反，这些配体的表达是在接触细胞应激（如致癌转化或传染性刺激）时诱发的，通过NKG2D受体表达免疫细胞（如自然杀手（NK）细胞，通过裂解触发受损细胞的消除。有趣的是，NKG2DL表面表达在LSC亚聚众中被选择性地抑制，使这些细胞能够逃避NKG2D介质的免疫监测。在这里，我们提出了两种不同的流细胞学方法的并排分析，允许对癌细胞上的 NKG2DL 表面表达进行调查，即涉及泛配体识别的方法和涉及对单个配体的多种抗体染色的方法。这些方法可用于将具有假定癌症干细胞特性的可行 NKG2DL 负细胞亚聚众与 NKG2DL 阳性非 LSC 分离。
Introduction
NK细胞是先天免疫系统的重要影响者，可以识别和消除恶性细胞或有压力的健康细胞（例如，通过病毒感染），而无需事先刺激抗原1。这个过程通过激活受体的复杂剧目（如天然细胞毒性受体 （NCR）、NKG2D 和 CD16） 以及主要由杀手免疫球蛋白样受体 （KIR）2表示的抑制受体进行严格调控。KIR 与人体白细胞抗原 （HLA） I 类分子结合在体细胞上，确保自我识别并传达 NK 细胞耐受性。另一方面，缺乏自我识别和激活受体对目标细胞的配体的结合增加，导致细胞毒性颗粒的释放，导致NK细胞介导细胞毒性1。最后，NK细胞可以通过将激活受体CD16与表示Ig （FcR）2Fc 部分的目标结合来发挥抗体依赖性细胞毒性 （ADCC） 的作用。除了直接细胞毒性，NK细胞还可以触发细胞因子释放桥接与自适应免疫系统3与先天。
NKG2D 是 NK、NKT、+T 和天真的 CD8+ T 细胞4上表达的主要激活受体，使此类细胞毒性免疫细胞能够识别和解解 NKG2D 配体 （NKG2DL） 表达目标细胞。健康细胞通常不表达 NKG2DL。相反，NKG2DL表达是对恶性或病毒感染细胞的调节，使这些适应免疫清除5。
人类NKG2DL家族由8个已知分子组成，其中两个MHC I链相关分子A和B（MICA和MICB6）和巨细胞病毒UL16结合蛋白1/6（ULBP1-67）。NKG2DL 的表达在转录、转录后以及后翻译级别8上进行调节。因此，虽然NKG2DL表达在健康细胞表面通常无法检测到，但NKG2DL mRNA9和细胞内蛋白质表达在健康组织中报告。这种表达的功能相关性和这种不同表达模式背后的机制仍有待界定。
癌细胞中NKG2DL表达的机械调控是一个引人入胜的调查领域。已知与细胞应激（如热冲击应激通路9）或 DNA 损伤相关通路（如厌食性泰兰吉拉西亚变异 （ATM） 和 Rad3 相关 （ATR） 通路11）以及病毒或细菌感染有关的通路与 NKG2DL 表达12的诱导直接相关。然而，即使NKG2DL的表面表达已被有效地诱导，这种表达可以通过原解剖介质脱落再次丢失，这种机制与免疫逃生和一些癌症的临床预后差有关。
细胞表面 NKG2DL 的缺失也可能对 AML 患者发挥重要作用。在这里，用强化化疗治疗通常诱导缓解，但复发通常发生在白血病干细胞（LSC），选择性地生存化疗和逃避免疫反应。例如，正如我们最近所表明的，LSC通过抑制NK2DL表面表达14来逃避NK细胞裂解。
相反，没有表面NKG2DL表达可以作为一种方法来识别和恶毒地分离假定干细胞状细胞的亚群从散装对应白血病亚群。在这里，我们提出了两种流细胞学方法，可用于检测 NKG2DL 表面表达，从而识别白血病中的 NKG2DL 阴性干细胞，也许还可以用于其他癌症：泛配体表面识别方法和涉及单个或池状抗体染色的方法，以识别单个已知 NKG2DL 蛋白质。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们提出了两种流细胞测量方法，可以检测人类原体AML细胞上的NKG2DL表面表达。我们表明，这两种检测方法都可以与其他抗体染色（例如检测 CD34 表达式）配合使用。类似的染色也可以在其他主要细胞类型和细胞系上执行。
我们最近表明，在AML患者爆炸表面没有NKG2DL可以丰富LSC14。在 AML 中，NKG2DL 阴性但非 NKG2DL 阳性白血病亚聚众具有克隆和 体?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了瑞士国家科学基金会（179239）、抗癌基金会（Zuerich）、威廉·桑德基金会和CL（2019.042.1）以及诺华医学-生物研究基金会的资助。此外，该项目还根据玛丽·斯考多夫斯卡-库里第765104号赠款协议，从欧洲联盟的Horizo 2020研究和创新项目获得资金。我们感谢巴塞尔的流细胞学设施的支持。
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
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