We presenteren twee verschillende kleuringsprotocollen voor NKG2D ligand (NKG2DL) detectie in menselijke primaire acute myeloïde leukemie (AML) monsters. De eerste benadering is gebaseerd op een fusie-eiwit, in staat om alle bekende en potentieel nog onbekende liganden te herkennen, terwijl het tweede protocol afhankelijk is van de toevoeging van meerdere anti-NKG2DL-antilichamen.
Bij dezelfde patiënt bleek de afwezigheid van NKG2D liganden (NKG2DL) oppervlakteexpressie leukemische subpopulaties met stamceleigenschappen (zogenaamde leukemische stamcellen, LSC’s) te onderscheiden van meer gedifferentieerde tegenhanger leukemische cellen die geen ziekte-initiatiepotentieel hebben, hoewel ze vergelijkbare leukemiespecifieke genetische mutaties dragen. NKG2DL zijn biochemisch zeer diverse MHC klasse I-achtige zelfmoleculen. Gezonde cellen in homeostatische omstandigheden drukken over het algemeen geen NKG2DL uit op het celoppervlak. In plaats daarvan wordt de expressie van deze liganden geïnduceerd bij blootstelling aan cellulaire stress (bijv. oncogene transformatie of infectieuze stimuli) om eliminatie van beschadigde cellen via lysis te activeren via NKG2D-receptor-expresserende immuuncellen zoals nk-cellen (natural killer). Interessant is dat NKG2DL-oppervlakteexpressie selectief wordt onderdrukt in LSC-subpopulaties, waardoor deze cellen NKG2D-gemedieerde immuunbewaking kunnen ontwijken. Hier presenteren we een zij-aan-zij analyse van twee verschillende flowcytometriemethoden die het mogelijk maken om NKG2DL-oppervlakteexpressie op kankercellen te onderzoeken, d.w.z. een methode met pan-ligandherkenning en een methode waarbij meerdere antilichamen tegen enkelvoudige liganden worden gekleurd. Deze methoden kunnen worden gebruikt om levensvatbare NKG2DL-negatieve cellulaire subpopulaties te scheiden met putatieve kankerstamceleigenschappen van NKG2DL-positieve niet-LSC.
NK-cellen zijn belangrijke effectoren van het aangeboren immuunsysteem die kwaadaardige cellen of gestreste gezonde cellen (bijv. door een virale infectie) kunnen herkennen en elimineren zonder voorafgaande antigeenstimulatie1. Dit proces wordt strak gereguleerd via een complex repertoire van activerende receptoren (zoals natuurlijke cytotoxiciteitsreceptoren (NVR’s), NKG2D en CD16) en remmende receptoren die grotendeels worden vertegenwoordigd door killer immunoglobuline-achtige receptoren (KIR’s)2. Binding van KIR’s aan humane leukocytenantigeen (HLA) klasse I moleculen op somatische cellen zorgt voor zelfherkenning en brengt NK celtolerantie over. Aan de andere kant veroorzaken afwezigheid van zelfherkenning en verhoogde binding van activerende receptoren aan hun liganden op de doelcellen de afgifte van cytotoxische korrels die leiden tot NK-celgemedieerde cytotoxiciteit1. Ten slotte kunnen NK-cellen antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) uitoefenen door de activerende receptor CD16 te binden aan doelen die het Fc-gedeelte van Ig (FcR)uitdrukken 2. Afgezien van directe cytotoxiciteit kunnen NK-cellen ook cytokine-afgifte activeren die de aangeboren stof overbrugt met het adaptieve immuunsysteem3.
NKG2D is een belangrijke activerende receptor uitgedrukt op NK, NKT, γδ T en naïeve CD8+ T-cellen4 die dergelijke cytotoxische immuuncellen in staat stelt om NKG2D ligand (NKG2DL) te herkennen en te lyseren en doelcellen uit te drukken. Gezonde cellen drukken NKG2DL vaak niet uit. In plaats daarvan wordt de NKG2DL-expressie geherreguleerd op kwaadaardige of met virussen geïnfecteerde cellen om deze vatbaar te maken voor immuunklaring5.
De menselijke NKG2DL-familie bestaat uit acht bekende moleculen waaronder de twee MHC I-ketengerelateerde moleculen A en B (MICA en MICB6) en het cytomegalovirus UL16-bindende eiwitten 1–6 (ULBP1-67). De expressie van NKG2DL is gereguleerd op de transcriptie, post-transcriptionele en de post-translationele niveaus8. Als zodanig, terwijl NKG2DL-expressie meestal niet detecteerbaar is op het oppervlak van gezonde cellen, werden NKG2DL mRNA9 en intracellulaire eiwitexpressie gerapporteerd in gezonde weefsels. De functionele relevantie van een dergelijke expressie en de mechanismen die aan dergelijke discrepante expressiepatronen ten grondslag liggen , moeten nog worden gedefinieerd10.
De mechanistische regulatie van NKG2DL expressie in de kankercellen is een fascinerend onderzoeksgebied. Trajecten waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij cellulaire stress, bijvoorbeeld de hitteschokstressroute9, of DNA-schadegerelateerde paden, zoals de ataxie telangiectasia gemuteerde (ATM) en Rad3-gerelateerde (ATR) route11, evenals virale of bacteriële infecties zijn direct gekoppeld aan de inductie van NKG2DL-expressie12. Echter, zelfs als oppervlakte expressie van NKG2DL effectief is geïnduceerd, kan deze expressie opnieuw verloren gaan door proteolytisch-gemedieerde afwerping, een mechanisme geassocieerd met immuunontsnapping en slechte klinische prognose bij sommige kankers13.
De afwezigheid van celoppervlak NKG2DL kan ook een belangrijke rol spelen bij patiënten met AML. Hier veroorzaakt behandeling met intensieve chemotherapie vaak remissie, maar terugval treedt vaak op door leukemische stamcellen (LSC), die selectief chemotherapieën overleven en immuunrespons ontwijken. Zoals we onlangs hebben laten zien, ontsnappen LSC’s bijvoorbeeld aan NK-cellysis door NKG2DL-oppervlakteexpressie14 teonderdrukken.
Omgekeerd kan de afwezigheid van oppervlakte NKG2DL-expressie worden gebruikt als een methode om putatieve stamachtige subpopulaties van cellen te identificeren en viably te isoleren van bulk tegenhanger leukemische subpopulaties. Hier presenteren we twee flow cytometrische benaderingen die kunnen worden gebruikt om NKG2DL-oppervlakteexpressie te detecteren en daarmee NKG2DL-negatieve stamcellen bij leukemie en misschien ook bij andere kankers te identificeren: een methode voor pan-ligand oppervlakteherkenning en een methode waarbij kleuring met enkele of gepoolde antilichamen individuele bekende NKG2DL-eiwitten herkent.
Hier presenteren we twee flow cytometrische methoden die NKG2DL-oppervlakteexpressie op menselijke primaire AML-cellen kunnen detecteren. We laten zien dat beide detectiemethoden kunnen worden gebruikt in combinatie met andere antilichaamkleuringen (bijv. het detecteren van CD34-expressie). Vergelijkbare kleuringen kunnen ook worden uitgevoerd op andere primaire celtypen en cellijnen.
We hebben onlangs laten zien dat de afwezigheid van NKG2DL op het oppervlak van AML-patiëntstralen LSC<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (179239), de Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), de Wilhelm Sander Foundation aan CL (2019.042.1) en de Novartis Foundation for medical-biological research aan C.L. Bovendien heeft dit project financiering ontvangen van het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 765104. We danken de Flow Cytometry Facility in Basel voor de steun.
7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |