Здесь мы представляем протокол для подготовки и культивирования метастатического геммозефалического барьера микро-среды опухоли, а затем количественно его состояние с использованием конфокальных изображений и искусственного интеллекта (машинное обучение).
Метастазы мозга являются наиболее смертоносными поражениями рака; 10-30% всех раковых метастазов в мозг, со средним выживанием всего 5-20 месяцев, в зависимости от типа рака. Чтобы уменьшить бремя метастатических опухолей мозга, необходимо решить пробелы в базовых и переводческих знаниях. Основные проблемы включают нехватку воспроизводимых доклинических моделей и связанных с ними инструментов. Трехмерные модели метастазирования мозга могут дать соответствующие молекулярные и фенотипические данные, используемые для удовлетворения этих потребностей в сочетании с специализированными инструментами анализа. Кроме того, по сравнению с моделями мурина, орган-на-чип модели опухолевых клеток пациента, проходящих геммоэнцефалический барьер в микроокноронику мозга генерировать результаты быстро и более интерпретируются с количественными методами, таким образом, под силу высокой пропускной способности тестирования. Здесь мы описываем и демонстрируем использование новой 3D микрофлюидной ниши мозга крови (МКББН), где несколько элементов ниши можно культурировал в течение длительного периода (несколько дней), флуоресцентно изображены конфокальные микроскопии, и изображения реконструированы с использованием инновационной конфокальные томографии техники; все они направлены на то, чтобы понять развитие микро-метастазов и изменений в микро-среде опухоли (TME) в повторяемой и количественной манере. Мы демонстрируем, как изготовить, семена, изображения, и анализировать раковые клетки и TME клеточных и гуморальных компонентов, используя эту платформу. Кроме того, мы показываем, как искусственный интеллект (ИИ) используется для выявления внутренних фенотипических различий раковых клеток, способных проходить через модель мБН, и присваивать им объективный индекс метастатического потенциала мозга. Наборы данных, генерируемые этим методом, могут быть использованы для ответа на основные и трансляционные вопросы о метастазах, эффективности терапевтических стратегий и роли TME в обоих.
Метастазы мозга являются наиболее смертоносными поражениями рака; 10-30% всех раковых метастазов в мозг, со средним выживанием только 5-20 месяцев, в зависимости оттипа рака 1,2. Основной вопрос, который возникает при изучении метастазов рака, как суб клоны мигрируют из гуморальной среды кровотока в орган,такой как мозг 3,,4. Этот вопрос привел к многим вариациям миграции, вторжения и экстравазии анализов. Все эти методы разделяют критический шаг подсчета или измерения свойств клеток, которые перемещаются из одного места в другое в ответ на стимул. Большинство миграционных анализов легко доступны используются для изучения двумерной (2D) миграции раковых клеток. Они прояснены богатство знаний; однако, они не резюмируют трехмерный характер системы in vivo, что другие методы могут обеспечить5. Поэтому необходимо изучать микросреду опухоли (ТМЭ) в трехмерных (3D) системах, но подходы к анализу, доступные для 3D-структур, ограничены и зачастую несовместимы.
Одним из самых популярных 3D-инструментов является камера Boyden, которая состоит из мембраны, подвешенной в нижней части колодеца, разделяющей два отдельных региона. Бойден ввел анализ для изучения лейкоцитов хемотаксис4. Нижние регионы могут быть разнообразны по химии или другимсредствам 6,,7, чтобы побудить клетки в верхнем регионе мигрировать в нижнюю область. Наиболее распространенным подходом к количественной оценке количества клеток, которые мигрировали является освобождение клеток из нижней части мембраны с помощью буферного раствора, подставить их, а затем подсчитать их на основе количества содержания ДНК врастворе 7. Этот косвенный подход подвержен ошибке оператора из-за изменчивости техники и процедура уничтожает информацию о фенотипе рака и микро-среде. Вариации анализа камеры Бойдена включают фиксацию мигрирующих клеток, которые остаются на мембране, но только обеспечивает количество клеток, которые больше не являются жизнеспособными длядальнейшего изучения 6,,8,,9.
Из-за ограничений камеры Бойдена и роста инноваций в микрофлюидном сообществе, были разработаны чипы миграционного анализа, которые наблюдают движение клеток в ответ на стимул в одном направлении, а нетри 10,,11,12. Эти миграционные анализы облегчают контроль над такими факторами, как поток или разделениеодной ячейки 13,14, которые позволяют лучше работать над результатами;, однако их 2D-формат неизбежно теряет некоторую динамическую информацию. Недавние исследования были сосредоточены на экстравазии (т.е. движение клеток из циркуляции в ткани, такие как гемовоградный барьер) в 3Dсреде 14,15. Экстравазия расстояние в ткани и зондирования поведение, которое происходит на клеточном барьере / мембраны более изысканным, чем измерения почерпнутые с помощью либо камеры Бойден или 2D микрофлюидных миграцииустройства 16. Таким образом, устройства, позволяющие осуществлять соответствующую визуализацию и анализ 3D-экстравазии, имеют решающее значение для фиксации этих сложных измерений, но отсутствуют в литературе.
Независимо от миграционных анализов, были разработаны надежные методы визуализации для магнитно-резонансной томографии (МРТ) и томографии, которые способны идентифицировать и точно реконструировать ткани в 3Dпространстве 17,,18. Эти методы приобретают изображения в z-стеках и сегментных части изображения на основе свойств ткани, а затем преобразуют сегментированные изображения втрехмерные сетки 19,,20,,21. Это позволяет врачам визуализировать в 3D отдельных органов, костей и сосудов, чтобы помочь в хирургическом планировании или помощи в диагностикерака или сердечных заболеваний 22,23. Здесь мы покажем, что эти подходы могут быть адаптированы для использования на микроскопических образцах и 3D-устройствах экстравасации.
С этой целью мы разработали инновационный метод конфокальные томографии, представленный в настоящем, который обеспечивает гибкость для изучения экстравазации опухолевых клеток через мембрану путем адаптации существующих томографических инструментов. Этот подход позволяет изучить всю гамму поведения раковых клеток, как они взаимодействуют с клеточным барьером, таких как эндотелиальный слой клеток. Раковые клетки обладают зондирующим поведением; некоторые из них могут вторгнуться, но остаются близко к мембране, в то время как другие пересекают барьер легко. Этот метод способен дать информацию о фенотипе клетки во всех измерениях24. Использование этого подхода для изучения TME является относительно недорогим, простым в интерпретации и воспроизводимым, по сравнению с более сложными моделями in vivo murine. Представленная методология должна обеспечить сильную основу для изучения многих типов опухолей и микро-сред путем адаптации стромальной области.
Мы описываем и демонстрируем использование 3D микрофлюидной ниши мозга крови (мББН) платформы(рисунок 1),где критические элементы барьера и ниши (микрососудистые эндотелиальные клетки мозга и астроциты) могут быть отучены в течение длительногопериода (примерно до 9 дней), флуоресцентно изображены с помощьюконфокальной микроскопии, а изображения реконструированы с использованием нашей конфокалиограммы . все направлено на понимание развития микро-метастазов и изменений в микро-среде опухоли в повторяемой и количественной манере. Интерфейс гемового барьера с нишей мозга состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, которые укрепляются мембраной подвала, астроцитными ногами иперицитами 25. Мы избирательно сосредоточились на астроцитах и эндотелиальных компонентах, учитывая их важность в формировании и регуляции геммоградно-мозгового барьера. Мы демонстрируем, как изготовить, семена, изображения, и анализировать раковые клетки и опухолевые микро-среды клеточных и гуморальных компонентов, используя эту платформу. Наконец, мы показываем, как машинное обучение может быть использовано для выявления внутренних фенотипических различий раковых клеток, которые способны проходить через модель мББН и присвоить им объективный индекс метастатическогопотенциала мозга 24. Наборы данных, генерируемые этим методом, могут быть использованы для ответа на основные и трансляционные вопросы о метастазах, терапевтических стратегиях и роли TME в обоих.
Мы разработали и представили новый метод, который адаптирует инструменты, часто используемые в клинических анализах изображений для измерения экстравазии и миграции раковых клеток через эндотелиальный барьер в ткани мозга. Мы считаем, что такой подход может быть полезен как для измер…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим лабораторию Steeg в Национальном институте рака за щедрое пожертвование клеток MDA-MB-231-BR-GFP. Конфокальцная микроскопия была проведена в Институте биоинтерфейсов Мичиганского университета (BI). Цитометрия потока была выполнена в Университете Мичигана поток цитометрии ядра. Вирусные векторы были созданы Университетом Мичигана Vector Core. Мы также благодарим Келли Кидвелл за руководство в статистическом анализе этих данных.
Финансирования:
C.R.O. была частично поддержана стипендией NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) и 1R21CA245597-01. T.M.W. была частично поддержана 1R21CA245597-01 и Национальным центром продвижения переводческих наук Национальных институтов здравоохранения под номером UL1TR002240. Финансирование материалов и характеристики было предоставлено Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, Фонд METAvivor, и Фонд исследований рака молочной железы. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точки зрения Национальных институтов здравоохранения
0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
A1 confocal microscope | Nikon | ||
acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
Fiji software | ImageJ | ||
glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
Jupyter notebook | Anaconda | ||
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
Orange software | University of Ljubljana | ||
Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |