قياس كمية الورم النقيلي الدماغ البيئة الدقيقة باستخدام الجهاز على A رقاقة 3D نموذج, التعلم الآلي, والتصوير المقطعي confocal
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لإعداد واستزراع حاجز الدم في الدماغ الورم النقيلي البيئة الدقيقة ومن ثم تحديد حالته باستخدام التصوير confocal والذكاء الاصطناعي (التعلم الآلي).
Abstract
الانبثاث الدماغية هي الآفات السرطانية الأكثر فتكا; 10-30٪ من جميع السرطانات تنتشر إلى الدماغ، مع متوسط البقاء على قيد الحياة فقط ~ 5-20 أشهر، اعتمادا على نوع السرطان. للحد من عبء الورم النقيلي في الدماغ، يجب معالجة الثغرات في المعرفة الأساسية والترجمة. وتشمل التحديات الرئيسية ندرة النماذج السابقة للتكرار والأدوات المرتبطة بها. يمكن أن تسفر النماذج ثلاثية الأبعاد من الانبثاث الدماغي عن البيانات الجزيئية والذينة ذات الصلة المستخدمة لتلبية هذه الاحتياجات عند دمجها مع أدوات التحليل المخصصة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع نماذج مورين، نماذج الجهاز على رقاقة من الخلايا السرطانية المريض عبور حاجز الدم في الدماغ في البيئة الدقيقة تولد نتائج بسرعة وأكثر قابلية للتفسير مع الأساليب الكمية، وبالتالي قابلة لاختبار الإنتاجية عالية. هنا وصف ونوضح استخدام رواية 3D ميكروفلورويديك الدماغ منصة (μmBBN) حيث عناصر متعددة من مكانة يمكن أن تكون تربية لفترة طويلة (عدة أيام), صورت الفلورسنت عن طريق المجهر confocal, والصور التي أعيد بناؤها باستخدام تقنية التصوير المقطعي confocal مبتكرة; تهدف جميع لفهم تطور الانبثاث الدقيق والتغيرات في البيئة الدقيقة الورم (TME) بطريقة متكررة وكمية. نحن نُوضح كيفية تصنيع، البذور، الصورة، وتحليل الخلايا السرطانية ومكونات TME الخلوية والخلطية، وذلك باستخدام هذه المنصة. وعلاوة على ذلك، فإننا نظهر كيف يتم استخدام الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) لتحديد الاختلافات الظاهرية الجوهرية للخلايا السرطانية القادرة على العبور من خلال نموذج μmBBN وتعيينها على مؤشر موضوعي لإمكانات النقيلي الدماغ. يمكن استخدام مجموعات البيانات الناتجة عن هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الأساسية والترجمة حول الانبثاث، وفعالية الاستراتيجيات العلاجية، ودور TME في كليهما.
Introduction
الانبثاث الدماغية هي الآفات السرطانية الأكثر فتكا; 10-30٪ من جميع السرطانات تنتشر إلى الدماغ، مع بقاء متوسط فقط ~ 5-20 أشهر، اعتمادا على نوع السرطان1،2. والسؤال الرئيسي الذي يطرح نفسه عند دراسة الانبثاث السرطان هو كيف هجرة المستنسخات الفرعية من بيئة فكية من مجرى الدم إلى جهاز مثل الدماغ3،4. وقد أدى هذا السؤال إلى العديد من الاختلافات من الهجرة والغزو، والجرايس البذخ. كل هذه الأساليب حصة الخطوة الحاسمة من عد أو قياس خصائص الخلايا التي تنتقل من موقع إلى آخر استجابة للحافز. معظم الهجرات المتاحة بسهولة تستخدم لدراسة هجرة ثنائية الأبعاد للخلايا السرطانية. وقد أوضحت هذه الثروة من المعرفة؛ ومع ذلك ، فإنها لا تُلخي الطبيعة ثلاثية الأبعاد لنظام vivo الذي يمكن أن توفره طرق أخرى5. لذلك ، من الضروري دراسة البيئة الدقيقة للورم (TME) في الأنظمة ثلاثية الأبعاد (3D) ، ولكن طرق التحليل المتاحة للهياكل ثلاثية الأبعاد محدودة وغير متسقة في كثير من الأحيان.
واحدة من الأدوات 3D الأكثر شعبية هي غرفة بويدن التي تتكون من غشاء معلق في الجزء السفلي من بئر، وفصل اثنين من المناطق المتميزة. قدم بويدن المقايسة لدراسة الكريات البيض chemotaxis4. قد تختلف المناطق السفلية عن طريق الكيمياء أو وسائل أخرى6،7 لحث الخلايا في المنطقة العليا على الهجرة إلى المنطقة السفلى. النهج الأكثر شيوعا لتحديد عدد الخلايا التي هاجرت هو تحرير الخلايا من أسفل الغشاء باستخدام محلول عازل، وزل منها، ومن ثم عدها على أساس كمية محتوى الحمض النووي في الحل7. هذا النهج غير المباشر عرضة لخطأ المشغل بسبب تنوع التقنية ويدمر الإجراء المعلومات حول النمط الظاهري للسرطان والبيئة الدقيقة. الاختلافات في غرفة Boyden فحص تنطوي على تثبيت الخلايا المهاجرة التي تبقى على الغشاء, ولكن يوفر فقط عدد الخلايا التي لم تعد قابلة للتطبيق لمواصلة الدراسة6,8,9.
بسبب القيود المفروضة على غرفة بويدن ونمو الابتكارات في المجتمع microfluidic، وقد وضعت رقائق فحص الهجرة التي مراقبة حركة الخلايا استجابة لحافز في اتجاه واحد بدلا من ثلاثة10،11،12. تسهل هذه المقايسات الهجرة السيطرة على عوامل مثل التدفق أو فصل خلية واحدة13،14 التي تمكن من تفسير أفضل للنتائج؛ ومع ذلك، فإن تنسيقها 2D يفقد حتما بعض المعلومات الحيوية. وقد ركزت الدراسات الحديثة على البذخ (أي، حركة الخلايا من الدورة الدموية إلى الأنسجة، مثل حاجز الدم في الدماغ) في بيئة 3D14،15. المسافة البذخ في الأنسجة والسلوك التحقيق الذي يحدث في الحاجز الخلوي / الغشاء هو أكثر دقة من القياسات التي تم جمعها باستخدام إما غرفة بويدن أو جهاز الهجرة microfluidic 2D16. وبالتالي، فإن الأجهزة التي تمكن التصوير المناسب وتحليل البذخ ثلاثي الأبعاد هي حاسمة لالتقاط هذه القياسات المتطورة ولكنها تفتقر إلى المؤلفات.
مستقلة عن عمليات الفحص الهجرة، وقد تم تطوير تقنيات التصوير القوية للتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والتصوير المقطعي التي هي قادرة على تحديد وإعادة بناء الأنسجة بدقة في الفضاء 3D17،18. هذه التقنيات الحصول على الصور في مداخن ض وأجزاء جزء من الصورة على أساس خصائص الأنسجة ومن ثم تحويل الصور مجزأة إلى شبكات ثلاثية الأبعاد19،20،21. وهذا يسمح للأطباء تصور في 3D الفردية والعظام والأوعية للمساعدة في التخطيط الجراحي أو المساعدة في تشخيص السرطان أو أمراض القلب22,23. هنا، سوف نظهر أن هذه النهج يمكن تكييفها للاستخدام على العينات المجهرية وأجهزة البذخ 3D.
وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير تقنية التصوير المقطعي confocal المبتكرة، التي قدمت هنا، والتي توفر المرونة لدراسة البذخ من الخلايا السرطانية عبر غشاء من خلال تكييف أدوات التصوير المقطعي القائمة. هذا النهج يتيح دراسة سلسلة كاملة من السلوكيات الخلايا السرطانية لأنها تتفاعل مع حاجز الخلوية, مثل طبقة الخلايا البطانية. تظهر الخلايا السرطانية سلوكيات التحقيق. قد يغزو البعض ولكن تبقى قريبة من الغشاء، في حين أن البعض الآخر اجتياز الحاجز بسهولة. هذه التقنية قادرة على تقديم معلومات حول النمط الظاهري للخلية في جميع الأبعاد24. استخدام هذا النهج لدراسة TME على حد سواء غير مكلفة نسبيا، وسهلة التفسير، وقابلة للتكرار، بالمقارنة مع أكثر تعقيدا في نماذج مارين الجسم الحي. وينبغي أن توفر المنهجية المقدمة أساسا قويا لدراسة أنواع كثيرة من الأورام والبيئات الصغرى من خلال تكييف منطقة السترومال.
نحن وصف وإثبات استخدام 3D ميكروفلويديك الدماغ منصة (μmBBN) منصة(الشكل 1)حيث العناصر الحرجة من الحاجز والمتخصصة (خلايا الدماغ البطانية الدقيقة الأوعية الدموية والخلايا الفلكية) يمكن أن تكون استزراع لفترة طويلة (ما يصل إلى 9 أيام تقريبا)، صورت الفلورسنت عن طريق المجهر confocal، والصور التي أعيد بناؤها باستخدام لدينا تقنية التصوير المقطعي confocal(الشكل 2). تهدف جميع لفهم تطور الانبثاث الجزئي والتغيرات في البيئة الدقيقة الورم بطريقة متكررة وكمية. وتتألف واجهة حاجز الدماغ الدم مع مكانة الدماغ من خلايا البطانية الدقيقة الدماغ التي يتم تعزيزها بواسطة غشاء الطابق السفلي, أقدام استروسيتي, و25. ركزنا بشكل انتقائي على مكونات الأسترويتي والبطانية نظراً للأهمية التي لها في تشكيل وتنظيم حاجز الدم في الدماغ. نحن نُوضح كيفية تصنيع، البذور، الصورة، وتحليل الخلايا السرطانية والورم الجزئي البيئة الخلوية والمكونات الخلطية، وذلك باستخدام هذه المنصة. وأخيرا، فإننا نظهر كيف يمكن استخدام التعلم الآلي لتحديد الاختلافات الظاهرية الجوهرية للخلايا السرطانية التي هي قادرة على العبور من خلال نموذج μmBBN، وتعيين لهم مؤشرا موضوعيا من إمكانات النقيلي الدماغ24. يمكن استخدام مجموعات البيانات الناتجة عن هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الأساسية والتوانية حول الانبثاث والاستراتيجيات العلاجية ودور TME في كليهما.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد طورنا وقدمنا طريقة جديدة تكيّف الأدوات التي تستخدم في كثير من الأحيان في تحليلات التصوير السريري لقياس البذخ وهجرة الخلايا السرطانية من خلال حاجز البطانية في أنسجة الدماغ. ونحن نثير هذا النهج يمكن أن تكون مفيدة لكل من قياسات في المختبرات والمحنتين. لقد أظهرنا استخدامه على نظام microfluidic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مختبر شتيغ، في المعهد الوطني للسرطان على التبرع السخي من خلايا MDA-MB-231-BR-GFP. تم إجراء المجهر Confocal في جامعة ميشيغان معهد Biointerfaces (BI). تم إجراء عملية استئصال cytometry التدفق في جامعة ميشيغان تدفق Cytometry الأساسية. تم إنشاء ناقلات الفيروسية من قبل جامعة ميشيغان النواة الناقلة. كما نشكر كيلي كيدويل على التوجيه في التحليل الإحصائي لهذه البيانات.
التمويل:
تم دعم C.R.O. جزئيًا من قبل زمالة التدريب المعاهد القومية للصحة T-32 (T32CA009676) و 1R21CA245597-01. تم دعم T.M.W. جزئيًا من قبل 1R21CA245597-01 والمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة UL1TR002240. تم توفير التمويل للمواد وتوصيف من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1R21CA245597-01، P30CA046592، 5T32CA009676-23، CA196018، AI116482، مؤسسة ميتافيور، ومؤسسة أبحاث سرطان الثدي. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
- Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
- Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
