장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화
Summary
여기에서는 혈액 뇌 장벽 전이성 종양 미세 환경을 준비하고 배양한 다음 공초점 이미징 및 인공 지능 (기계 학습)을 사용하여 상태를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
뇌 전이는 가장 치명적인 암 병변; 모든 암의 10-30%는 암 유형에 따라 ~ 5-20 개월의 중간 생존과 함께 뇌로 전이됩니다. 뇌 전이성 종양 부담을 줄이기 위해 기본 및 번역 지식의 격차를 해결해야합니다. 주요 과제는 재현 가능한 전임상 모델 및 관련 도구의 빈약성을 포함합니다. 뇌 전이의 3차원 모델은 전용 분석 도구와 결합될 때 이러한 요구를 해결하는 데 사용되는 관련 분자 및 페노티픽 데이터를 얻을 수 있습니다. 더욱이, 뮤린 모델에 비해, 뇌 마이크로환경으로 혈액뇌 장벽을 통과하는 환자 종양 세포의 장기-온-칩 모델은 결과를 빠르게 생성하고 정량적 방법으로 해석이 가능하므로 높은 처리량 테스트에 의존한다. 여기서 우리는 틈새 시장의 다중 요소가 장기간(며칠) 동안 배양될 수 있는 새로운 3D 미세 유체 혈액 뇌 틈새(μmBBN) 플랫폼의 사용을 설명하고 시연하며, 공초점 현미경검사에 의해 형광으로 이미지되고, 혁신적인 공초점 단층 촬영 기술을 사용하여 재구성된 이미지; 모두 반복가능하고 정량적인 방식으로 종양 미세 환경(TME)의 미세 전이 및 변화를 이해하는 것을 목표로 했다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 암세포 및 TME 세포 및 유머 성분을 제조, 씨앗, 이미지 및 분석하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 인공 지능 (AI)이 모델 μmBBN을 통해 통과 할 수있는 암세포의 본질적인 현상적 차이를 식별하고 뇌 전이성 전위의 객관적인 지수를 할당하는 데 어떻게 사용되는지 보여줍니다. 이 방법에 의해 생성된 데이터 세트는 전이에 대한 기본 및 번역 적 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다, 치료 전략의 효능, 둘 다에서 TME의 역할.
Introduction
뇌 전이는 가장 치명적인 암 병변; 모든 암의 10-30%는 뇌로 전이되고, 암 유형1에따라 5-20개월의 중간생존율로, 1,2. 암 전이를 연구할 때 발생하는 주요 질문은 서브 클론이 혈류의 유머 환경에서 뇌3,,4와같은 기관으로 이동하는 방법입니다. 이 질문은 이주, 침략 및 사치스러운 에세이의 많은 변형으로 이어졌습니다. 이러한 모든 방법은 자극에 대한 응답으로 한 위치에서 다른 위치로 이동하는 셀의 특성을 계산하거나 측정하는 중요한 단계를 공유합니다. 쉽게 구할 수 있는 대부분의 이주 소는 암세포의 2차원 (2D) 이동을 연구하기 위하여 이용됩니다. 이들은 풍부한 지식을 해명했다. 그러나, 그들은 다른 방법이 제공할 수 있는 생체 내 시스템의 입체적 특성을 회수하지 않는다5. 따라서 3차원(3D) 시스템에서 종양 미세 환경(TME)을 연구할 필요가 있지만 3D 구조에 사용할 수 있는 분석 접근법은 제한적이고 종종 일치하지 않는다.
가장 인기있는 3D 도구 중 하나는 두 개의 별개의 영역을 분리, 우물의 바닥에 중단 막으로 구성된 보덴 챔버입니다. 보이덴은 백혈구 화학요법4를연구하기 위해 분석법을 도입했다. 상기 하부 영역은 화학 또는 다른수단6,,7이 상부 부위에서 세포를 유도하여 하부 영역으로 이동하도록 유도함으로써 변화될 수 있다. 마이그레이션된 세포의 수를 정량화하는 가장 일반적인 접근법은 완충액을 사용하여 멤브레인의 바닥에서 세포를 방출하고, 이를 lyse한 다음, 용액7에서DNA 함량의 양에 기초하여 세포를 계산하는 것이다. 이러한 간접적인 접근법은 기술 적 변동성으로 인해 운전자 오류가 발생하기 쉬우며 절차는 암 표현형 및 마이크로 환경에 대한 정보를 파괴합니다. 보덴 챔버 분석의 변화는 막에 남아 있는 철새 세포의 고정을 포함하지만, 지속적인 연구를 위해 더 이상 실행 가능한 세포의 수를 제공합니다6,,8,,9.
보덴 챔버의 한계와 미세 유체 지역 사회에서 혁신의 성장으로 인해, 이주 분석 칩은 3개의 10,,11,,12가아닌 한 방향으로 자극에 대응하여 세포의 움직임을 관찰하는 개발되었습니다. 이러한 마이그레이션 해석은 결과의 더 나은 해석을 가능하게 하는 흐름 또는 단세포분리(13,14)와14 같은 요인에 대한 제어를 용이하게 한다. 그러나 2D 형식은 필연적으로 동적 정보를 잃게 됩니다. 최근 연구는 3D 환경에서 사치(즉, 혈액 뇌 장벽과 같은 조직으로 순환에서 세포의 이동)에 초점을 맞추고 있다14,,15. 세포 장벽/멤브레인에서 발생하는 조직 및 프로빙 거동으로의 사치거리는 보덴 챔버 또는 2D 미세 유체 이동장치(16)를사용하여 수집된 측정보다 더 정제된다. 따라서 3D 사치에 대한 적절한 이미징 및 분석을 가능하게 하는 장치는 이러한 정교한 측정을 캡처하는 데 매우 중요하지만 문헌에는 부족합니다.
이주 와 무관하게, 강력한 이미징 기술은 3D 공간17,,18에서조직을 식별하고 정확하게 재구성할 수 있는 자기 공명 영상(MRI) 및 단층 촬영을 위해 개발되었다. 이러한 기술은 조직의 특성에 기초하여 이미지의 z 스택 및 세그먼트 부분에서 이미지를 수집한 다음 분할된 이미지를 3차원 메쉬19,,20,,21로변환한다. 이를 통해 의사는 3D 개별 장기, 뼈 및 혈관을 시각화하여 수술 계획에 도움을 주거나 암 또는 심장 질환 의 진단에 도움을 주거나22,,23을할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 이 접근이 현미경 견본 및 3D 사치 장치에 사용하기 위해 적응될 수 있다는 것을 보여줄 것입니다.
이를 위해, 우리는 기존의 단층 촬영 도구를 적응하여 멤브레인을 통해 종양 세포의 사치를 연구할 수 있는 유연성을 제공하는 본원에 제시된 혁신적인 공초점 단층 촬영 기술을 개발했습니다. 이 접근은 내피 세포 층과 같은 세포 장벽과 상호 작용할 때 암 세포 행동의 전체 영역의 연구를 가능하게 합니다. 암세포는 탐구 행동을 나타낸다; 일부는 침입할 수 있지만 멤브레인에 가깝게 남아 있는 반면, 다른 사람들은 장벽을 쉽게 통과합니다. 이 기술은 모든 차원에서 셀의 표현형에 대한 정보를 산출할 수있다(24). TME를 연구하기 위하여 이 접근법을 사용하는 것은 생체 내 murine 모형에 있는 더 복잡한에 비교될 때, 상대적으로 저렴하고, 해석하기 쉽고, 재현할 수 있습니다. 제시된 방법론은 기질 영역을 적응시킴으로써 많은 유형의 종양 및 미세 환경의 연구를 위한 강력한 기초를 제공해야 합니다.
3D 미세유체 혈액 뇌 틈새(μmBBN)플랫폼(그림 1)의사용을 설명하고 시연하며, 장벽과 틈새(뇌 미세혈관 내피 세포 및 성상세포)의 중요한 원소가 장기간 배양될 수 있는 곳(약 9일), 공초점 미세검사에 의해 형광을 배양하고, 공초점 마이크로카피에 의해 배양된형광(2)을사용하여 재초점한 이미지를 사용하여 재구성됨); 모두 반복가능하고 정량적인 방식으로 종양 미세 환경의 미세 전이 및 변화를 이해하는 것을 목표로 했다. 뇌 틈새 와 혈액 뇌 장벽 인터페이스는 지하 막에 의해 강화되는 뇌 미세 혈관 내피 세포로 구성되어, 성상세포 발, 및 pericytes25. 우리는 혈액 뇌 장벽의 형성과 조절에 중요성을 감안할 때 성상 세포및 내피 성분에 선택적으로 집중했습니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 암세포 및 종양 미세 환경 세포 및 유머 성분을 제조, 종자, 이미지 및 분석하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 기계 학습이 모델 μmBBN을 통해 통과 할 수있는 암세포의 본질적인 현상적 차이를 식별하고 뇌 전이성 전위24의객관적인 지수를 할당하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 이 방법에 의해 생성된 데이터 세트는 전이, 치료 전략 및 둘 다에서 TME의 역할에 대한 기본 및 번역 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 뇌 조직으로내피 장벽을 통해 암세포의 사치화 및 이동측정을 위해 임상 이미징 분석에 자주 활용되는 도구를 적응시키는 새로운 방법을 개발하고 제시했습니다. 우리는 이 접근 방식이 생체 내 및 체외 측정 모두에 유용할 수 있다고 제기합니다. 우리는 뇌 혈관을 재구성하는 3D 미세 유체 시스템에 그것의 사용을 입증했습니다. 암 세포 측정은 이 기술을 사용하여 양화된 거리, 부피, 구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231-BR-GFP 세포의 관대 한 기부에 대 한 국립 암 연구소에서 Steeg 연구소에 감사 합니다. 공초점 현미경 검사는 미시간 대학 생물 인터페이스 연구소 (BI)에서 수행되었다. 흐름 세포측정은 미시간 유동 세포측정 코어 대학에서 수행되었다. 바이러스 벡터는 미시간 벡터 코어 대학에 의해 만들어졌습니다. 우리는 또한 이러한 데이터의 통계 분석에 대한 지침을 켈리 키드웰 감사합니다.
자금:
C.R.O.는 NIH T-32 교육 펠로우십(T32CA0009676) 및 1R21CA245597-01에 의해 부분적으로 지원되었습니다. T.M.W.는 1R21CA245597-01 및 국립 보건원의 번역 과학 발전 센터인 UL1TR002240에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 재료 및 특성화에 대한 기금은 수여 번호 1R21CA245597-01, P30CA0046592, 5T32CA0009676-23, CA196018, AI116482, 메타비보르 재단, 메타비보르 재단, 유방암 연구 하에 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 제공되었다. 이 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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