臓器オンAチップ3Dモデル、機械学習、共焦点断層法による脳転移性腫瘍微小環境の定量化
Summary
ここでは、血液脳関門転移性腫瘍微小環境を調製し培養し、共焦点イメージングと人工知能(機械学習)を用いてその状態を定量化するためのプロトコルを提示する。
Abstract
脳転移は最も致死的な癌病変である。すべての癌の10〜30%が脳に転移し、癌の種類に応じて生存期間の中央値は〜5〜20ヶ月である。脳転移性腫瘍の負担を軽減するためには、基礎的および翻訳的な知識のギャップに対処する必要があります。主な課題には、再現可能な前臨床モデルおよび関連ツールの貧弱性が含まれます。脳転移の三次元モデルは、専用の分析ツールと組み合わせると、これらのニーズに対処するために使用される関連する分子および表現型データを生成することができます。さらに、マウスモデルと比較して、血液脳関門を脳微小環境に通過する患者腫瘍細胞の臓器オンチップモデルは、結果を迅速に生成し、定量的方法でより解釈可能であり、したがって、高スループット検査に適しています。ここでは、新しい3Dマイクロ流体血液脳ニッチ(μmBBN)プラットフォームの使用を説明し、ニッチの複数の要素を長期間(数日間)培養し、共焦点顕微鏡で蛍光的に画像化し、革新的な共焦点断層撮影技術を使用して再構築された画像を説明し、実証します。全ては、マイクロ転移の発症と、繰り返し可能かつ定量的な方法での腫瘍微小環境(TME)の変化を理解することを目的としている。このプラットフォームを用いて、がん細胞やTME細胞および体液性成分を作製、種、画像化、分析する方法を実演します。さらに、モデルμmBBNを介して通過できるがん細胞の本質的な異型性差を特定し、脳転移電位の客観的指標を割り当てる、人工知能(AI)がどのように使用されているかを示す。この方法で生成されるデータセットは、転移、治療戦略の有効性、およびTMEの役割に関する基本的な質問と翻訳的な質問に答えるために使用することができます。
Introduction
脳転移は最も致死的な癌病変である。全ての癌の10~30%が脳に転移し、癌タイプ1、22に応じて、生存期間の中央値は約5~201ヶ月である。癌転移を研究する際に生じる主な問題は、サブクローンが血流の液性環境から脳33、44などの器官に移行する方法である。この質問は、移行、侵略、および外挿アッセイの多くのバリエーションにつながっています。これらの方法はすべて、刺激に応答してある場所から別の場所に移動する細胞の特性をカウントまたは測定する重要なステップを共有します。容易に利用できるほとんどの移動のアッセイは癌細胞の二次元(2D)のマイグレーションを研究するために使用される。これらは豊富な知識を解明しました。しかし、他の方法が5を提供できるin vivoシステムの立体的性質を再現しません。したがって、3次元(3D)系で腫瘍微小環境(TME)を研究する必要がありますが、3D構造に対して利用可能な解析アプローチは限られており、しばしば矛盾しています。
最も人気のある3Dツールの1つは、2つの異なる領域を分離し、井戸の底に吊り下げられた膜で構成されるボイデン室です。ボイデンは白血球の化学軸4を研究するアッセイを導入した。底部領域は、化学または他の手段66、77によって変化させ、上領域の細胞を下領域に移行するように誘導することができる。移行した細胞の数を定量化する最も一般的なアプローチは、バッファー溶液を用いて膜底から細胞を放出し、それらを溶解し、そして溶液7中のDNA含有量の量に基づいてそれらを数える。この間接的なアプローチは、技術の変動のためにオペレータエラーを起こしやすいため、処置は癌表現型および微小環境に関する情報を破壊する。ボイデンチャンバーアッセイのバリエーションは、膜上に残っている回遊細胞の固定を伴うが、継続的な研究66、8、98,9のためにもはや生存できない細胞の数を提供する。
ボイデン室の限界とマイクロ流体コミュニティにおける技術革新の成長により、移行アッセイチップは、3つの10、11、12ではなく一11,12方向の刺激に応答して細胞の動きを観察する開発が行われている。これらの移行アッセイは、結果のより良い解釈を可能にするフローまたは単一細胞分離13、14,14などの要因の制御を容易にする。ただし、2D 形式では動的な情報が失われるのは避けがちです。最近の研究では、3D環境14,15,15における血管外開法(すなわち、血液脳関門などの組織への循環からの細胞の移動)に焦点を当てている。細胞バリア/膜で起こる組織およびプローブ挙動への飛離距離は、ボイデンチャンバーまたは2Dマイクロ流体移動装置16のいずれかを使用して収集された測定値よりも洗練されている。したがって、3D外挿の適切なイメージングと解析を可能にするデバイスは、これらの高度な測定値をキャプチャするために重要ですが、文献には欠けています。
移動アッセイとは無関係に、3D空間17,18,18において組織を同定し、正確に再構成することができる磁気共鳴画像法(MRI)および断層撮影用の堅牢なイメージング技術が開発されている。これらの技術は、組織の特性に基づいて画像のzスタックおよびセグメント部分の画像を取得し、セグメント化された画像を3次元メッシュ19、20、2120,21に変換する。19これにより、医師は、3D個々の臓器、骨、および血管を視覚化して、癌または心臓病22、23,23の診断を外科的計画または援助する。ここでは、これらのアプローチが顕微鏡標本や3D外挿装置での使用に適応できることを示す。
この結果、我々は、既存の断層撮影ツールを適応させることによって膜全体の腫瘍細胞の飛散を研究する柔軟性を与える、本明細書で提示される革新的な共焦点断層撮影技術を開発した。このアプローチにより、内皮細胞層などの細胞バリアと相互作用するがん細胞行動の全範囲の研究が可能になります。がん細胞は、プローブ行動を示します;侵入するが膜の近くに残る人もいれば、バリアを容易に横断する人もいる。この技術は、全次元24における細胞の表現型に関する情報を得ることができる。この手法を使用して TME を研究することは、比較的安価で、解釈しやすく、再現性が高く、インビボマウスモデルの複雑性と比較すると、比較的複雑です。提示された方法論は、多くの種類の腫瘍および微小環境の研究のための強力な基礎を提供すべきである。
我々は、バリアおよびニッチ(脳内脳内皮細胞および星状細胞)の重要な要素を長期間培養できる3D微小流体血液脳ニッチ(μmBBN)プラットフォーム(図1)の使用を記述し、実証する。全ては、繰り返し可能かつ定量的な方法で、マイクロ転移の発症と腫瘍微小環境への変化を理解することを目的としている。脳ニッチとの血液脳関門界は、地下膜によって強化された脳内皮細胞、星血球足、および近球25から構成される。血液脳関門の形成と調節においてその重要性を考えると、アストロサイトおよび内皮成分に選択的に焦点を当てた。このプラットフォームを用いて、がん細胞や腫瘍微小環境細胞および体液性成分の製造、種子、画像、分析の方法を実演します。最後に、機械学習を用いて、モデルμmBBNを介して通過できる癌細胞の本質的な形素の違いを特定し、脳転移電位24の客観的指標を割り当てる方法を示す。この方法で生成されたデータセットは、転移、治療戦略、およびTMEの役割に関する基本的および翻訳的な質問に答えるために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
内皮バリアを介して脳組織へのがん細胞の外挿や移動を測定するために、臨床画像解析に頻繁に利用されるツールを適応させる新しい方法を開発し、発表しました。このアプローチは、生体内測定とインビトロ測定の両方に役立ちます。脳血管系を再現する3Dマイクロ流体システムでの使用を実証しました。がん細胞の測定は、この技術を使用して、外挿距離、体積、球面性、体積による外?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国立がん研究所のSteeg Labに対し、MDA-MB-231-BR-GFP細胞の寛大な寄付に感謝します。共焦点顕微鏡は、ミシガン大学バイオインターフェース研究所(BI)で行われました。フローサイトメトリーは、ミシガン大学フローサイトメトリーコアで行われました。ウイルスベクターは、ミシガン大学ベクターコアによって作成されました.また、これらのデータの統計分析におけるガイダンスに対するケリー・キッドウェルに感謝します。
資金：
C.R.O.は、NIH T-32トレーニングフェローシップ(T32CA009676)と1R21CA245597-01によって部分的にサポートされました。T.M.W.は、1R21CA245597-01と国立衛生研究所の国立トランスレーショナルサイエンス推進センターによって部分的にサポートされました。材料と特性評価のための資金は、賞番号1R21CA245597-01、P30CA046592、5T32CA009676-23、CA196018、AI116482、METAvivor財団、乳癌研究財団の下で国立衛生研究所によって提供されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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