Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Kultivierung einer Bluthirnschranke metastasierenden Tumor Mikro-Umgebung und dann quantifizieren seinen Zustand mit konfokaler Bildgebung und künstliche Intelligenz (Machine Learning).
Abstract
Hirnmetastasen sind die tödlichsten Krebsläsionen; 10-30% aller Krebsarten metastasieren auf das Gehirn, mit einem medianen Überleben von nur 5-20 Monaten, abhängig vom Krebstyp. Um die Belastung durch metastasierende Tumore im Gehirn zu verringern, müssen Lücken in grundlegenden und translationalen Kenntnissen behoben werden. Zu den größten Herausforderungen gehören ein Mangel an reproduzierbaren präklinischen Modellen und zugehörigen Werkzeugen. Dreidimensionale Modelle der Hirnmetastasierung können die relevanten molekularen und phänotypischen Daten liefern, die in Kombination mit speziellen Analysetools verwendet werden, um diesen Anforderungen gerecht zu werden. Darüber hinaus erzeugen Organ-on-a-Chip-Modelle von Patiententumorzellen, die die Hirnschranke des Blutes in die Mikroumgebung des Gehirns durchqueren, im Vergleich zu murinen Modellen schnell Ergebnisse und sind mit quantitativen Methoden interpretierbarer und somit für Tests mit hohem Durchsatz geeignet. Hier beschreiben und demonstrieren wir den Einsatz einer neuartigen 3D-Mikrofluidischen Bluthirnnische (mBBN), auf der mehrere Elemente der Nische über einen längeren Zeitraum (mehrere Tage) kultiviert, durch konfokale Mikroskopie fluoreszierend dargestellt und die Bilder mit einer innovativen konfokalen Tomographie-Technik rekonstruiert werden können; alle zielten darauf ab, die Entwicklung von Mikrometastasen und Veränderungen der Tumor-Mikroumgebung (TME) in einer wiederholbaren und quantitativen Weise zu verstehen. Mit dieser Plattform zeigen wir, wie man die Krebszellen und TME-Zell- und Humorkomponenten fabriziert, aussaiert, absaiert und analysiert. Darüber hinaus zeigen wir, wie künstliche Intelligenz (KI) verwendet wird, um die intrinsischen phänotischen Unterschiede von Krebszellen zu identifizieren, die in der Lage sind, durch ein Modell zu übertragen und ihnen einen objektiven Index des metastasierenden Potenzials des Gehirns zuzuweisen. Die mit dieser Methode generierten Datensätze können verwendet werden, um grundlegende und translationale Fragen zur Metastasierung, zur Wirksamkeit therapeutischer Strategien und zur Rolle der TME in beiden zu beantworten.
Introduction
Hirnmetastasen sind die tödlichsten Krebsläsionen; 10-30% aller Krebsarten metastasieren zum Gehirn, mit einem medianen Überleben von nur 5-20 Monaten, abhängig vom Krebstyp1,2. Eine Hauptfrage, die sich beim Studium der Krebsmetastasierung stellt, ist, wie Subklone aus der humoralen Umgebung des Blutkreislaufs in ein Organ wie das Gehirn3,4wandern. Diese Frage hat zu vielen Variationen von Migration, Invasion und Extravasation Assays geführt. Alle diese Methoden teilen den entscheidenden Schritt des Zählens oder Messens von Eigenschaften von Zellen, die sich als Reaktion auf einen Stimulus von einem Standort zum anderen bewegen. Die meisten migrationsfreundlichen Assays werden verwendet, um die zweidimensionale (2D) Migration von Krebszellen zu untersuchen. Diese haben eine Fülle von Wissen aufgeklärt; Sie rekapitulieren jedoch nicht den dreidimensionalen Charakter des in vivo-Systems, den andere Methoden5liefern können. Daher ist es notwendig, die Tumor-Mikroumgebung (TME) in dreidimensionalen (3D) Systemen zu untersuchen, aber die Analyseansätze für 3D-Strukturen sind begrenzt und oft inkonsistent.
Eines der beliebtesten 3D-Werkzeuge ist eine Boyden-Kammer, die aus einer Membran besteht, die an der Unterseite eines Brunnens aufgehängt ist und zwei verschiedene Bereiche trennt. Boyden führte den Test ein, um Leukozyten-Chemotaxis zu untersuchen4. Die unteren Bereiche können durch Chemie oder andere Mittel6,,7 variiert werden, um Zellen im oberen Bereich dazu zu bringen, in den unteren Bereich zu migrieren. Der häufigste Ansatz zur Quantifizierung der Anzahl der zellen, die migriert wurden, besteht darin, die Zellen von der Unterseite der Membran mithilfe einer Pufferlösung freizusetzen, sie zu lysieren und sie dann basierend auf der Menge des DNA-Gehalts in der Lösung7zu zählen. Dieser indirekte Ansatz ist aufgrund der Technikvariabilität anfällig für Bedienerfehler und das Verfahren zerstört Informationen über den Krebsphänotyp und die Mikroumgebung. Variationen des Boyden-Kammer-Assays beinhalten die Fixierung von Zugzellen, die auf der Membran verbleiben, liefert aber nur eine Anzahl von Zellen, die für die weitere Studie6,8,9nicht mehr lebensfähig sind.
Aufgrund der Einschränkungen der Boydenkammer und des Wachstums von Innovationen in der mikrofluidischen Gemeinschaft wurden Migrations-Assay-Chips entwickelt, die die Bewegung von Zellen als Reaktion auf einen Stimulus in eine Richtung anstatt drei10,11,12beobachten. Diese Migrationstests erleichtern die Kontrolle über Faktoren wie Strömung oder Einzelzelltrennung13,14, die eine bessere Interpretation der Ergebnisse ermöglichen; Ihr 2D-Format verliert jedoch unweigerlich einige dynamische Informationen. Jüngste Studien haben sich auf die Extravasation (d.h. die Bewegung von Zellen aus der Zirkulation in ein Gewebe, wie die Blut-Hirn-Schranke) in einer 3D-Umgebung14,15konzentriert. Der Extravasationsabstand in Gewebe und das Sondierungsverhalten, das an der zellulären Barriere/Membran auftritt, ist raffinierter als Messungen, die entweder mit der Boyden-Kammer oder einem 2D-Mikrofluid-Migrationsgerät16gewonnen wurden. Daher sind Geräte, die eine angemessene Bildgebung und Analyse der 3D-Extravasation ermöglichen, entscheidend, um diese ausgeklügelten Messungen zu erfassen, aber es fehlt in der Literatur.
Unabhängig von Migrationstests wurden robuste bildgebende Verfahren für die Magnetresonanztomographie (MRT) und Tomographie entwickelt, die gewebe im 3D-Raum17,18identifizieren und genau rekonstruieren können. Diese Techniken erfassen Bilder in Z-Stacks und Segmentteilen des Bildes basierend auf den Eigenschaften des Gewebes und konvertieren dann die segmentierten Bilder in dreidimensionale Netze19,20,21. Dies ermöglicht es Ärzten, in 3D einzelne Organe, Knochen und Gefäße zu visualisieren, um bei der chirurgischen Planung oder Hilfe bei der Diagnose von Krebs oder Herzerkrankungen zu helfen22,23. Hier zeigen wir, dass diese Ansätze für den Einsatz an mikroskopischen Proben und 3D-Extravasationsgeräten angepasst werden können.
Zu diesem Zweck haben wir die innovative konfokale Tomographie-Technik entwickelt, die hier vorgestellt wird und die Flexibilität bietet, die Extravasation von Tumorzellen über eine Membran zu untersuchen, indem bestehende Tomographie-Tools angepasst werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der gesamten Bandbreite des Verhaltens von Krebszellen, da sie mit einer zellulären Barriere interagieren, wie z. B. einer endotheliaalen Zellschicht. Krebszellen zeigen Sondierungsverhalten; einige können eindringen, bleiben aber in der Nähe der Membran, während andere die Barriere leicht durchqueren. Diese Technik ist in der Lage, Informationen über den Phänotyp der Zelle in allen Dimensionen24zu liefern. Mit diesem Ansatz zur Untersuchung der TME ist sowohl relativ kostengünstig, leicht zu interpretieren und reproduzierbar, im Vergleich zu komplexeren in vivo murinen Modellen. Die vorgestellte Methodik sollte eine starke Grundlage für die Untersuchung vieler Arten von Tumoren und Mikroumgebungen bieten, indem die Stromregion angepasst wird.
Wir beschreiben und demonstrieren die Verwendung einer 3D-Mikrofluidischen Bluthirnnische(MBBN)Plattform ( Abbildung 1 ), in der kritische Elemente der Barriere und Nische (mikrovaskuläre Endkörperzellen und Astrozyten des Gehirns) über einen längeren Zeitraum (ca. bis zu 9 Tage) kultiviert, durch konfokale Mikroskopie fluoreszierend dargestellt und die mit unserer konfokalen Tomographie rekonstruierten Bilder rekonstruiert werden können ( Abbildung2); alle zielten darauf ab, die Entwicklung von Mikrometastasen und Veränderungen der Tumor-Mikroumgebung in einer wiederholbaren und quantitativen Weise zu verstehen. Die Schnittstelle zur Blut-Hirn-Schranke mit der Gehirnnische besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, die durch Kellermembran, Astrozytenfüße und Pericyten25verstärkt werden. Wir konzentrierten uns selektiv auf die Astrozyten- und Endothelkomponenten, da sie für die Bildung und Regulierung der Blut-Hirn-Schranke wichtig sind. Mit dieser Plattform zeigen wir, wie man die Krebszellen und tumormikro-Umweltzell- und Humorkomponenten fabriziert, aussaiert, absaiert und analysiert. Schließlich zeigen wir, wie maschinelles Lernen genutzt werden kann, um die intrinsischen phänotypischen Unterschiede von Krebszellen zu identifizieren, die in der Lage sind, durch ein Modell zu übertragen und ihnen einen objektiven Index des metastasierenden Potenzials des Gehirns zuzuweisen24. Die mit dieser Methode generierten Datensätze können verwendet werden, um grundlegende und translationale Fragen zu Metastasen, therapeutischen Strategien und der Rolle der TME in beiden zu beantworten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine neue Methode entwickelt und vorgestellt, die Werkzeuge anpasst, die häufig in klinischen bildgebenden Analysen zur Messung der Extravasation und Migration von Krebszellen durch eine Endothelbarriere in das Hirngewebe verwendet werden. Wir stellen dar, dass dieser Ansatz sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Messungen nützlich sein kann; wir haben seine Verwendung auf einem 3D-Mikrofluidsystem demonstriert, das die Gehirnvaskulatur rekapituliert. Krebszellmessungen, einschließlich extravasierter En…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Steeg Lab am National Cancer Institute für die großzügige Spende von MDA-MB-231-BR-GFP Zellen. Die konfokale Mikroskopie wurde am University of Michigan Biointerfaces Institute (BI) durchgeführt. Die Durchflusszytometrie wurde an der University of Michigan Flow Cytometry Core durchgeführt. Virale Vektoren wurden von der University of Michigan Vector Core erstellt. Wir danken auch Kelley Kidwell für die Anleitung bei der statistischen Analyse dieser Daten.
Finanzierung:
C.R.O. wurde teilweise von einem NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) und 1R21CA245597-01 unterstützt. T.M.W. wurde teilweise von 1R21CA245597-01 und dem National Center for Advancing Translational Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer UL1TR002240 unterstützt. Die Finanzierung von Materialien und Charakterisierung wurde von National Cancer Institute of the National Institutes of Health unter der Auszeichnung Nr. 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation und der Breast Cancer Research Foundation bereitgestellt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
- Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
- Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
