Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos
Summary
Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.
Abstract
La fracción estromal-vascular (FSV) del tejido adiposo blanco (WAT) es notablemente heterogénea y consta de numerosos tipos de células que contribuyen funcionalmente a la expansión y remodelación de la WAT en la edad adulta. Un obstáculo tremendo para el estudio de las implicaciones de esta heterogeneidad celular es la incapacidad de aislar fácilmente subpoblaciones celulares funcionalmente distintas de WAT SVF para análisis in vitro e in vivo. La tecnología de secuenciación de células individuales ha identificado recientemente subpoblaciones de células perivasculares PDGFRβ+ fibroinflamatorias y adipogénicas funcionalmente distintas en depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos. Los progenitores fibroinflamatorios (denominados “FIP”) son células productoras de colágeno no adipogénicas que pueden ejercer un fenotipo proinflamatorio. Las células precursoras de adipocitos (APC) PDGFRβ+ son altamente adipogénicas tanto in vitro como in vivo tras el trasplante de células. Aquí, describimos múltiples métodos para el aislamiento de estas subpoblaciones de células estromales de depósitos de WAT intraabdominales murinos. Las FIP y las APC pueden aislarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o aprovechando la tecnología de perlas inmunomagnéticas basadas en anticuerpos biotinilados. Las células aisladas se pueden utilizar para el análisis molecular y funcional. El estudio de las propiedades funcionales de la subpoblación de células estromales de forma aislada ampliará nuestro conocimiento actual de la remodelación del tejido adiposo en condiciones fisiológicas o patológicas a nivel celular.
Introduction
El tejido adiposo blanco (WAT) representa el principal sitio para el almacenamiento de energía en los mamíferos. Dentro de este tejido, los adipocitos, o “células grasas”, almacenan el exceso de calorías en forma de triglicéridos, empaquetados en grandes gotas lipídicas uniloculares. Además, los adipocitos segregan multitud de factores que regulan diversos aspectos de la homeostasis energética 1,2,3. Los adipocitos constituyen la mayor parte del volumen de WAT; sin embargo, los adipocitos solo representan menos del 50% del total de células encontradas en WAT 4,5. El compartimento no adipocitario de WAT, o fracción estromal-vascular (SVF), es bastante heterogéneo y contiene células endoteliales vasculares, células inmunitarias residentes en tejidos, fibroblastos y poblaciones de células precursoras de adipocitos (APC).
WAT es excepcional por su notable capacidad de expansión de tamaño a medida que aumenta la demanda de almacenamiento de energía. El mantenimiento de esta plasticidad tisular es esencial, ya que el almacenamiento adecuado de lípidos en WAT protege contra la deposición ectópica deletérea de lípidos en tejidos no adiposos6. La forma en que los depósitos individuales de WAT experimentan esta expansión en respuesta al exceso calórico es un determinante crítico de la sensibilidad a la insulina en el contexto de la obesidad7. La expansión patológica de WAT, observada en individuos obesos con síndrome metabólico, se caracteriza por una expansión preferencial de los depósitos viscerales de WAT a expensas del tejido graso subcutáneo metabólicamente favorable. Además, la resistencia a la insulina en la obesidad se asocia con la remodelación patológica de la WAT. Se caracteriza por crecimiento hipertrófico de los adipocitos existentes (aumento de tamaño), angiogénesis inadecuada, inflamación metabólica crónica, acumulación de componentes de la matriz extracelular (fibrosis) e hipoxia tisular 8,9. Estos fenotipos WAT de obesidad se asocian con esteatosis hepática y resistencia a la insulina, similar a lo que se observa en la condición de lipodistrofia (ausencia de WAT funcional). Por el contrario, la expansión saludable de la WAT se observa en la población obesa metabólicamente sana y se caracteriza por la expansión preferencial de la WAT subcutánea protectora y la expansión del depósito a través de la hiperplasia de los adipocitos10. El reclutamiento de nuevos adipocitos está mediado por la diferenciación de novo de los adipocitos a partir de las células precursoras de los adipocitos (APC) (denominada “adipogénesis”). La hiperplasia de los adipocitos coincide con grados relativamente más bajos de fibrosis WAT e inflamación metabólica 6,11. Una multitud de tipos de células dentro del microambiente WAT influyen directamente en la salud y la capacidad de expansión de WAT en la obesidad12. Como tal, la definición de la función de los diversos tipos de células presentes en WAT sigue siendo una alta prioridad para el campo.
Durante la última década, se han empleado varias estrategias para definir y aislar APC nativas de WAT SVF13 humano y de ratón. Estas estrategias aíslan las APC en función de la expresión en la superficie celular de marcadores comunes de células madre/progenitoras mesenquimales mediante técnicas de separación celular basadas en anticuerpos. Estos enfoques incluyen la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), el uso de anticuerpos marcados con fluoróforos o la separación inmunomagnética de perlas (es decir, anticuerpos modificados químicamente). Las proteínas de la superficie celular dirigidas para el aislamiento de APC incluyen PDGFRα, PDGFRβ, CD34 y SCA-1. Estos enfoques han ayudado a enriquecer a las APC; Sin embargo, las poblaciones celulares aisladas en base a estos marcadores son bastante heterogéneas. Estudios muy recientes de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) han puesto de manifiesto la heterogeneidad molecular y funcional de las células estromales dentro de la fracción estromal-vascular aislada (SVF) de WAT murino 14,15,16,17. A partir de nuestros propios análisis funcionales y de scRNA-seq, hemos identificado y caracterizado subpoblaciones de células perivasculares PDGFRβ+ adipogénicas inmunomoduladoras y adipogénicas funcionalmente distintas en el compartimento estromal del WAT intraabdominal en ratones adultos15. Los precursores fibroinflamatorios, o FIP, representan una subpoblación prominente de células PDGFRβ+ y pueden aislarse en función de la expresión de LY6C (células LY6C+ PDGFRβ+)15. Los FIP carecen de capacidad adipogénica, ejercen una fuerte respuesta proinflamatoria a diversos estímulos, producen colágeno y secretan factores antiadipogénicos15. La actividad proinflamatoria y fibrogénica de estas células aumenta en asociación con la obesidad en ratones, implicando a estas células como reguladoras de la remodelación de WAT. La subpoblación LY6C-CD9-PDGFRβ+ representa células precursoras de adipocitos (APC). Estas APCs están enriquecidas en la expresión de Pparg y otros genes pro-adipogénicos, y se diferencian fácilmente en adipocitos maduros in vitro e in vivo15. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de estas distintas poblaciones celulares de depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos utilizando FACS, y la separación inmunomagnética de perlas con anticuerpos biotinilados. Este protocolo se puede utilizar para aislar subpoblaciones progenitoras adiposas funcionalmente distintas de múltiples depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos machos y hembras15. El estudio de estas poblaciones celulares funcionalmente distintas de forma aislada puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión actual de los mecanismos moleculares que regulan la adipogénesis y la remodelación del tejido adiposo intraabdominal en la salud y la enfermedad.
El protocolo a continuación detalla el aislamiento de los progenitores adiposos del WAT del epidídimo murino; sin embargo, el mismo procedimiento puede utilizarse para aislar las células correspondientes de los depósitos de WAT mesentérico y retroperitoneal de ratones machos y hembras15. Un protocolo detallado sobre cómo identificar y aislar estos depósitos en ratones se puede encontrar en Bagchi et al.18. Este protocolo ha sido optimizado para el uso de ratones de 6-8 semanas de edad. La frecuencia y la capacidad de diferenciación de las APC pueden disminuir en asociación con el envejecimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cepa de ratones C57BL/6 es la cepa de ratón más utilizada en los estudios de obesidad inducida por la dieta. Los ratones C57BL/6 aumentan rápidamente de peso cuando se les administra una dieta alta en grasas (HFD) y desarrollan algunas de las características prominentes del síndrome metabólico asociado con la obesidad (por ejemplo, resistencia a la insulina e hiperlipidemia). En particular, la expansión de WAT que ocurre en asociación con la alimentación con dieta alta en grasas (HFD) ocurre de manera especí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Lisa Hansen y Kirsten Vestergaard por su excelente asistencia técnica, y a P. Scherer, N. Joffin y C. Crewe por la lectura crítica del manuscrito. Los autores agradecen al UTSW Flow Cytometry Core por su excelente orientación y asistencia en el desarrollo de los protocolos descritos aquí. R.K.G. es compatible con NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 y NIDDK R01 DK119163. J.P. está patrocinado por un premio predoctoral del Fondo de Innovación de Dinamarca.
Materials
| Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation | |||
| 40 and 100 µm cell strainers | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5ml polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digestion Buffer (for 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.) | Roche | 11088882001 | |
| 0.15 g BSA (1.5 % final cc.) | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs | |||
| 5X MojoSort Buffer (MS buffer) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort Magnet (MS magnet) | BioLegend | 480019 | |
| 100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480015 | |
| Purity Check and FACS | |||
| 10X Red Blood Cell Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc block (Mouse CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Antibodies | |||
| Biotin CD45 | BioLegend | 103103 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| Biotin CD31 | BioLegend | 102503 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3 |
| Biotin CD9 | BioLegend | 124803 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Biotin LY6C | BioLegend | 128003 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Cell Culture and Differentiation | |||
| Gonadal APC Culture media (for 500mL) | |||
| 288 mL DMEM with 1 g/L glucose | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| 10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL 100% ITS premix | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| 50 µL 100 g/ml FGF-basic | R&D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL Pen/Strep | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µL Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested. |
References
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
- Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
- Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
- Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
- Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
- Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
- Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).
- Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
- Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
- Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861 (2018).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
- Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).
- Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
- Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).
