عزل المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية الأديبوجينية والليفية الالتهابية من مستودعات الفئران الدهنية داخل البطن
Summary
يصف هذا البروتوكول النهج التقني لعزل المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية الدهنية والالتهابية الليفية من مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء داخل البطن (WAT) عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو فصل الخرزة المغناطيسية المناعية.
Abstract
الجزء اللحمي الوعائي (SVF) للأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) غير متجانس بشكل ملحوظ ويتكون من العديد من أنواع الخلايا التي تساهم وظيفيا في توسيع وإعادة تشكيل WAT في مرحلة البلوغ. يتمثل أحد العوائق الهائلة أمام دراسة الآثار المترتبة على عدم التجانس الخلوي هذا في عدم القدرة على عزل مجموعات فرعية متميزة وظيفيا بسهولة من WAT SVF للتحليلات في المختبر وفي الجسم الحي. حددت تقنية تسلسل الخلية الواحدة مؤخرا مجموعات فرعية متميزة وظيفيا من الخلايا الالتهابية الليفية و PDGFRβ + حول الأوعية الدموية في مستودعات WAT داخل البطن للفئران البالغة. السلف الليفي الالتهابي (يسمى “FIPs”) هي خلايا منتجة للكولاجين غير دهنية المنشأ يمكنها ممارسة نمط ظاهري مؤيد للالتهابات. خلايا سلائف الخلايا الشحمية PDGFRβ + (APCs) عالية التسبب في الإدمان في المختبر وفي الجسم الحي عند زرع الخلايا. هنا ، نصف طرقا متعددة لعزل هذه المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية من مستودعات WAT داخل البطن. يمكن عزل FIPs و APCs عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) أو عن طريق الاستفادة من تقنية حبة الخرز المغناطيسي المناعي القائمة على الأجسام المضادة الحيوية. يمكن استخدام الخلايا المعزولة للتحليل الجزيئي والوظيفي. إن دراسة الخصائص الوظيفية للخلايا اللحمية الفرعية بمعزل عن غيرها ستوسع معرفتنا الحالية بإعادة تشكيل الأنسجة الدهنية في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية على المستوى الخلوي.
Introduction
تمثل الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) الموقع الرئيسي لتخزين الطاقة في الثدييات. داخل هذا النسيج ، تخزن الخلايا الشحمية ، أو “الخلايا الدهنية” ، السعرات الحرارية الزائدة في شكل دهون ثلاثية ، معبأة في قطرات دهنية كبيرة أحادية العين. علاوة على ذلك ، تفرز الخلايا الشحمية العديد من العوامل التي تنظم الجوانب المختلفة لتوازن الطاقة1،2،3. تشكل الخلايا الشحمية الجزء الأكبر من حجم WAT. ومع ذلك ، لا تمثل الخلايا الشحمية سوى أقل من 50٪ من إجمالي الخلايا الموجودة في WAT 4,5. المقصورة غير الشحمية في WAT ، أو الجزء اللحمي الوعائي (SVF) ، غير متجانسة تماما وتحتوي على خلايا بطانية وعائية وعائية ، وخلايا مناعية مقيمة في الأنسجة ، وخلايا ليفية ، ومجموعات خلايا سلائف الخلايا الشحمية (APC).
تعتبر WAT استثنائية في قدرتها الرائعة على التوسع في الحجم مع زيادة الطلب على تخزين الطاقة. يعد الحفاظ على مرونة الأنسجة أمرا ضروريا لأن التخزين الكافي للدهون في WAT يحمي من ترسب الدهون خارج الرحم الضارة في الأنسجة غير الدهنية6. الطريقة التي تخضع بها مستودعات WAT الفردية لهذا التوسع استجابة لزيادة السعرات الحرارية هي محدد حاسم لحساسية الأنسولين في إعداد السمنة7. يتميز توسع WAT المرضي ، الذي لوحظ في الأفراد الذين يعانون من السمنة المفرطة والذين يعانون من متلازمة التمثيل الغذائي ، بالتوسع التفضيلي لمستودعات WAT الحشوية على حساب الأنسجة الدهنية تحت الجلد المواتية الأيضية. علاوة على ذلك ، ترتبط مقاومة الأنسولين في السمنة بإعادة التشكيل المرضي ل WAT. يتميز هذا بالنمو الضخامي للخلايا الشحمية الموجودة (زيادة في الحجم) ، وعدم كفاية تكوين الأوعية الدموية ، والتهاب التمثيل الغذائي المزمن ، وتراكم مكونات المصفوفة خارج الخلية (التليف) ، ونقص الأكسجة في الأنسجة 8,9. ترتبط هذه الأنماط الظاهرية للسمنة WAT بالتنكس الدهني الكبدي ومقاومة الأنسولين ، على غرار ما لوحظ في حالة الحثل الشحمي (غياب وات وظيفي). في المقابل ، لوحظ توسع WAT الصحي في السكان الذين يعانون من السمنة المفرطة الأصحاء الأيضية ويتميز بالتوسع التفضيلي ل WAT الوقائي تحت الجلد وتوسيع المستودع من خلال تضخم الخلايا الشحمية10. يتم التوسط في تجنيد الخلايا الشحمية الجديدة عن طريق تمايز الخلايا الشحمية من خلايا السلائف الشحمية (APCs) (تسمى “تكوين الدهون”). يتزامن تضخم الخلايا الشحمية مع درجات أقل نسبيا من تليف WAT والتهاب التمثيل الغذائي 6,11. تؤثر العديد من أنواع الخلايا داخل البيئة الدقيقة WAT بشكل مباشر على صحة وقابلية توسع WAT في السمنة12. على هذا النحو ، يظل تحديد وظيفة أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في WAT أولوية عالية لهذا المجال.
على مدار العقد الماضي ، تم استخدام العديد من الاستراتيجيات لتحديد وعزل ناقلات الجنود المدرعة الأصلية عن الإنسان والفأر WAT SVF13. تعزل هذه الاستراتيجيات APCs بناء على تعبير سطح الخلية لعلامات الخلايا الجذعية / السلفية الشائعة باستخدام تقنيات فصل الخلايا القائمة على الأجسام المضادة. تشمل هذه الأساليب فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ، أو فصل الحبيبات المغناطيسية المناعية (أي الأجسام المضادة المعدلة كيميائيا). تشمل بروتينات سطح الخلية المستهدفة لعزل APCs PDGFRα و PDGFRβ و CD34 و SCA-1. وقد ساعدت هذه النهج على إثراء هذه النظم؛ ومع ذلك ، فإن مجموعات الخلايا المعزولة بناء على هذه العلامات غير متجانسة تماما. سلطت الدراسات الحديثة جدا لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الضوء على عدم التجانس الجزيئي والوظيفي للخلايا اللحمية داخل الجزء اللحمي الوعائي المعزول (SVF) من الفئران WAT14،15،16،17. من خلال تحليلاتنا الوظيفية وتحليلاتنا الوظيفية ، حددنا وميزنا مجموعات فرعية من الخلايا حول الأوعية الدموية المتميزة وظيفيا والمعدلة للدهون PDGFRβ + في المقصورة اللحمية ل WAT داخل البطن في الفئرانالبالغة 15. تمثل السلائف الالتهابية الليفية ، أو FIPs ، مجموعة فرعية بارزة من خلايا PDGFRβ + ويمكن عزلها بناء على تعبير LY6C (خلايا LY6C + PDGFRβ +) 15. تفتقر FIPs إلى القدرة المحفزة للدهون ، وتمارس استجابة قوية مؤيدة للالتهابات لمختلف المحفزات ، وتنتج الكولاجين ، وتفرز العوامل المضادة للدهون15. يزداد النشاط المؤيد للالتهابات والليفي لهذه الخلايا بالاقتران مع السمنة لدى الفئران ، مما يورط هذه الخلايا كمنظمات لإعادة تشكيل WAT. تمثل المجموعة الفرعية LY6C- CD9- PDGFRβ + خلايا سلائف الخلايا الشحمية (APCs). يتم إثراء هذه APCs في التعبير عن Pparg والجينات الأخرى المؤيدة للدهون ، وتتمايز بسهولة إلى خلايا دهنية ناضجة في المختبر وفي الجسم الحي15. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل مجموعات الخلايا المتميزة هذه من مستودعات WAT داخل البطن للفئران البالغة باستخدام FACS ، وفصل الحبيبات المغناطيسية المناعية بالأجسام المضادة للبيوتينيل. يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل المجموعات الفرعية السلفية الدهنية المتميزة وظيفيا من مستودعات WAT المتعددة داخل البطن للفئران الذكور والإناثالبالغة 15. قد تساهم دراسة مجموعات الخلايا المتميزة وظيفيا هذه في عزلة بشكل كبير في فهمنا الحالي للآليات الجزيئية التي تنظم تكوين الدهون وإعادة تشكيل الأنسجة الدهنية داخل البطن في الصحة والمرض.
يفصل البروتوكول أدناه عزل الأسلاف الدهنية من الفئران البربخية WAT. ومع ذلك ، يمكن استخدام نفس الإجراء لعزل الخلايا المقابلة من مستودعات WAT المساريقية وخلف الصفاق لكل من الفئران الذكور والإناث15. يمكن العثور على بروتوكول مفصل حول كيفية تحديد وعزل هذه المستودعات في الفئران في Bagchi et al.18. تم تحسين هذا البروتوكول لاستخدام الفئران 6-8 أسابيع من العمر. وقد ينخفض تواتر وقدرة ناقلات الجنود المدرعة وقدرتها على التمايز بالاقتران مع الشيخوخة.
Protocol
Representative Results
Discussion
سلالة C57BL / 6 من الفئران هي سلالة الفئران الأكثر استخداما في دراسات السمنة التي يسببها النظام الغذائي. تكتسب الفئران C57BL / 6 الوزن بسرعة عند وضعها على نظام غذائي غني بالدهون (HFD) وتطور بعض السمات البارزة لمتلازمة التمثيل الغذائي المرتبطة بالسمنة (على سبيل المثال ، مقاومة الأنسولين وفرط شحميات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعرب المؤلفون عن امتنانهم لليزا هانسن وكيرستن فيسترجارد للمساعدة الفنية الممتازة ، و P. Scherer و N. Joffin و C. Crewe على القراءة النقدية للمخطوطة. يشكر المؤلفون UTSW Flow Cytometry Core على التوجيه والمساعدة الممتازين في تطوير البروتوكولات الموضحة هنا. يتم دعم R.K.G. من قبل NIH NIDDK R01 DK104789 و NIDDK RC2 DK118620 و NIDDK R01 DK119163. JP برعاية جائزة ما قبل الدكتوراه من صندوق الابتكار الدنماركي.
Materials
| Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation | |||
| 40 and 100 µm cell strainers | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5ml polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digestion Buffer (for 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.) | Roche | 11088882001 | |
| 0.15 g BSA (1.5 % final cc.) | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs | |||
| 5X MojoSort Buffer (MS buffer) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort Magnet (MS magnet) | BioLegend | 480019 | |
| 100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480015 | |
| Purity Check and FACS | |||
| 10X Red Blood Cell Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc block (Mouse CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Antibodies | |||
| Biotin CD45 | BioLegend | 103103 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| Biotin CD31 | BioLegend | 102503 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3 |
| Biotin CD9 | BioLegend | 124803 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Biotin LY6C | BioLegend | 128003 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Cell Culture and Differentiation | |||
| Gonadal APC Culture media (for 500mL) | |||
| 288 mL DMEM with 1 g/L glucose | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| 10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL 100% ITS premix | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| 50 µL 100 g/ml FGF-basic | R&D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL Pen/Strep | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µL Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested. |
References
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
- Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
- Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
- Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
- Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
- Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
- Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).
- Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
- Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
- Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861 (2018).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
- Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).
- Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
- Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).
