Выделение субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из внутрибрюшных жировых депо мышей
Summary
В этом протоколе описан технический подход к выделению субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из депо внутрибрюшной белой жировой ткани (WAT) мышей путем сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, или отделения иммуномагнитных шариков.
Abstract
Стромально-васкулярная фракция (SVF) белой жировой ткани (WAT) удивительно неоднородна и состоит из многочисленных типов клеток, которые функционально способствуют расширению и ремоделированию WAT во взрослом возрасте. Огромным препятствием для изучения последствий этой клеточной гетерогенности является невозможность легко выделить функционально различные субпопуляции клеток из WAT SVF для анализа in vitro и in vivo. Технология секвенирования одиночных клеток недавно выявила функционально различные фибровоспалительные и адипогенные субпопуляции периваскулярных клеток PDGFRβ+ во внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей. Фибровоспалительные предшественники (называемые «FIP») представляют собой неадипогенные клетки, продуцирующие коллаген, которые могут проявлять провоспалительный фенотип. Клетки-предшественники адипоцитов (APC) PDGFRβ+ обладают высокой адипогенной способностью как in vitro, так и in vivo после трансплантации клеток. В данной статье мы описываем несколько методов выделения этих субпопуляций стромальных клеток из внутрибрюшных депо WAT мышей. FIP и APC могут быть выделены с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) или с помощью технологии иммуномагнитных гранул на основе биотинилированных антител. Выделенные клетки могут быть использованы для молекулярного и функционального анализа. Изучение функциональных свойств субпопуляции стромальных клеток в изоляции расширит наши текущие знания о ремоделировании жировой ткани в физиологических или патологических условиях на клеточном уровне.
Introduction
Белая жировая ткань (WAT) является основным местом хранения энергии у млекопитающих. В этой ткани адипоциты, или «жировые клетки», хранят избыточные калории в виде триглицеридов, упакованных в большие однокамерные липидные капли. Кроме того, адипоциты выделяют множество факторов, которые регулируют различные аспекты энергетического гомеостаза 1,2,3. Адипоциты составляют основную часть объема ВАТ; однако адипоциты составляют менее 50% от общего числа клеток, обнаруженных в WAT 4,5. Неадипоцитарный компартмент WAT, или стромально-васкулярная фракция (SVF), довольно гетероген и содержит сосудистые эндотелиальные клетки, тканевые резидентные иммунные клетки, фибробласты и популяции клеток-предшественников адипоцитов (APC).
WAT исключительна своей замечательной способностью расширяться в размерах по мере роста спроса на хранение энергии. Поддержание этой пластичности тканей имеет важное значение, поскольку адекватное хранение липидов в WAT защищает от вредного эктопического отложения липидов в нежировых тканях6. Способ, которым отдельные депо WAT претерпевают это расширение в ответ на избыток калорий, является критическим фактором, определяющим чувствительность к инсулину в условиях ожирения. Патологическое расширение ВАТ, наблюдаемое у лиц с ожирением и метаболическим синдромом, характеризуется преимущественным расширением висцеральных депо ВАТ за счет метаболически благоприятной подкожной жировой ткани. Кроме того, инсулинорезистентность при ожирении связана с патологическим ремоделированием ВАТ. Это характеризуется гипертрофическим ростом имеющихся адипоцитов (увеличением в размерах), недостаточным ангиогенезом, хроническим метаболическим воспалением, накоплением компонентов внеклеточного матрикса (фиброзом) и гипоксией тканей 8,9. Эти WAT-фенотипы ожирения связаны со стеатозом печени и инсулинорезистентностью, аналогично тому, что наблюдается при липодистрофии (отсутствии функциональной WAT). Напротив, здоровое расширение WAT наблюдается в метаболически здоровой популяции с ожирением и характеризуется преимущественным расширением защитного подкожного WAT и расширением депо через гиперплазию адипоцитов10. Рекрутирование новых адипоцитов опосредовано дифференцировкой адипоцитов de novo из клеток-предшественников адипоцитов (APC) (так называемая «адипогенез»). Гиперплазия адипоцитов совпадает с относительно более низкими степенями фиброза WAT и метаболического воспаления 6,11. Множество типов клеток в микроокружении WAT напрямую влияют на здоровье и расширяемость WAT при ожирении12. Таким образом, определение функций различных типов клеток, присутствующих в WAT, остается высокоприоритетным для данной области.
За последнее десятилетие было использовано несколько стратегий для определения и изоляции нативных APC от WAT SVF13 человека и мыши. Такие стратегии выделяют АПК на основе экспрессии на клеточной поверхности общих мезенхимальных маркеров стволовых/прогениторных клеток с использованием методов разделения клеток на основе антител. Эти подходы включают флуоресцентно-активируемую сортировку клеток (FACS) с использованием антител, меченных флуорофорами, или иммуномагнитное разделение шариков (т.е. химически модифицированные антитела). Белки клеточной поверхности, предназначенные для выделения APC, включают PDGFRα, PDGFRβ, CD34 и SCA-1. Эти подходы помогли обогатить APC; Однако клеточные популяции, выделенные на основе этих маркеров, достаточно неоднородны. Совсем недавние исследования секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq) выявили молекулярную и функциональную гетерогенность стромальных клеток в пределах изолированной стромально-васкулярной фракции (SVF) мышиного WAT 14,15,16,17. С помощью нашего собственного scRNA-seq и функционального анализа мы идентифицировали и охарактеризовали функционально различные иммуномодулирующие и адипогенные субпопуляции периваскулярных клеток PDGFRβ+ в стромальном компартменте внутрибрюшной WAT у взрослых мышей15. Фибровоспалительные предшественники, или FIP, представляют собой заметную субпопуляцию PDGFRβ+ клеток и могут быть выделены на основе экспрессии LY6C (LY6C+ PDGFRβ+ клеток)15. ФИП обладают адипогенной способностью, оказывают сильное провоспалительное реагирование на различные раздражители, продуцируют коллаген и секретируют антиадипогенные факторы15. Провоспалительная и фиброгенная активность этих клеток увеличивается в связи с ожирением у мышей, что делает эти клетки регуляторами ремоделирования ВАТ. Субпопуляция LY6C-CD9-PDGFRβ+ представляет собой клетки-предшественники адипоцитов (APC). Эти APC обогащены экспрессией Pparg и других проадипогенных генов и легко дифференцируются в зрелые адипоциты in vitro и in vivo15. Здесь мы предоставляем подробный протокол для выделения этих отдельных клеточных популяций из внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей с использованием FACS и отделения иммуномагнитных гранул с биотинилированными антителами. Этот протокол может быть использован для выделения функционально различных субпопуляций жировых предшественников из множественных внутрибрюшных депо WAT взрослых самцов и самок мышей15. Изучение этих функционально различных клеточных популяций по отдельности может внести большой вклад в наше текущее понимание молекулярных механизмов, которые регулируют адипогенез и ремоделирование внутрибрюшной жировой ткани в здоровом и больном состоянии.
В приведенном ниже протоколе подробно описано выделение жировых предшественников из придатка яичка матки мышей; однако та же процедура может быть использована для выделения соответствующих клеток из брыжеечных и забрюшинных депо WAT как самцов, так и самок мышей15. Подробный протокол о том, как идентифицировать и изолировать эти депо у мышей, можно найти в Bagchi et al.18. Этот протокол был оптимизирован для использования мышами в возрасте 6-8 недель. Частота и дифференцировочная способность АПК могут снижаться в связи со старением.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мышиная линия C57BL/6 является наиболее часто используемой линией мышей в исследованиях ожирения, вызванного диетой. Мыши C57BL/6 быстро набирают вес при посадке на диету с высоким содержанием жиров (HFD) и развивают некоторые характерные черты метаболического синдрома, связанные с ожирением …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Лизе Хансен и Кирстен Вестергаард за прекрасную техническую помощь, а также. Шереру, Н. Джоффину и К. Кру за критическое прочтение рукописи. Авторы благодарят UTSW Flow Cytometry Core за отличное руководство и помощь в разработке описанных здесь протоколов. R.K.G. поддерживается NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 и NIDDK R01 DK119163. J.P. спонсируется премией за докторскую степень от Инновационного фонда Дании.
Materials
| Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation | |||
| 40 and 100 µm cell strainers | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5ml polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digestion Buffer (for 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.) | Roche | 11088882001 | |
| 0.15 g BSA (1.5 % final cc.) | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs | |||
| 5X MojoSort Buffer (MS buffer) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort Magnet (MS magnet) | BioLegend | 480019 | |
| 100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480015 | |
| Purity Check and FACS | |||
| 10X Red Blood Cell Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc block (Mouse CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Antibodies | |||
| Biotin CD45 | BioLegend | 103103 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| Biotin CD31 | BioLegend | 102503 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3 |
| Biotin CD9 | BioLegend | 124803 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Biotin LY6C | BioLegend | 128003 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Cell Culture and Differentiation | |||
| Gonadal APC Culture media (for 500mL) | |||
| 288 mL DMEM with 1 g/L glucose | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| 10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL 100% ITS premix | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| 50 µL 100 g/ml FGF-basic | R&D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL Pen/Strep | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µL Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested. |
References
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
- Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
- Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
- Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
- Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
- Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
- Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).
- Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
- Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
- Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861 (2018).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
- Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).
- Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
- Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).
