Summary

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Published: August 16, 2020
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Abstract

De stromale-vasculaire fractie (SVF) van wit vetweefsel (WAT) is opmerkelijk heterogeen en bestaat uit talrijke celtypen die functioneel bijdragen aan de uitbreiding en hermodellering van WAT op volwassen leeftijd. Een enorme barrière voor het bestuderen van de implicaties van deze cellulaire heterogeniteit is het onvermogen om gemakkelijk functioneel verschillende celsubpopulaties te isoleren van WAT SVF voor in vitro en in vivo analyses. Single-cell sequencing-technologie heeft onlangs functioneel verschillende fibro-inflammatoire en adipogene PDGFRβ+ perivasculaire celsubpopulaties geïdentificeerd in intra-abdominale WAT-depots van volwassen muizen. Fibro-inflammatoire voorlopercellen (“FIP’s” genoemd) zijn niet-adipogene collageenproducerende cellen die een pro-inflammatoir fenotype kunnen uitoefenen. PDGFRβ+ adipocytenprecursorcellen (APC’s) zijn zowel in vitro als in vivo bij celtransplantatie zeer adipogeen. Hier beschrijven we meerdere methoden voor de isolatie van deze stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale WAT-depots van muizen. FIP’s en APC’s kunnen worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) of door gebruik te maken van op biotinylated antilichamen gebaseerde immunomagnetische pareltechnologie. Geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor moleculaire en functionele analyse. Het bestuderen van de functionele eigenschappen van de subpopulatie van stromale cellen in isolatie zal onze huidige kennis van de hermodellering van vetweefsel onder fysiologische of pathologische omstandigheden op cellulair niveau uitbreiden.

Introduction

Wit vetweefsel (WAT) vertegenwoordigt de belangrijkste plaats voor energieopslag bij zoogdieren. In dit weefsel slaan adipocyten, of ‘vetcellen’, overtollige calorieën op in de vorm van triglyceriden, verpakt in grote uniloculaire lipidedruppels. Bovendien scheiden adipocyten een groot aantal factoren af die verschillende aspecten van energiehomeostase reguleren 1,2,3. Adipocyten vormen het grootste deel van het WAT-volume; adipocyten vertegenwoordigen echter slechts minder dan 50% van het totale aantal cellen dat wordt aangetroffen in WAT 4,5. Het niet-adipocytencompartiment van WAT, of stromale-vasculaire fractie (SVF), is vrij heterogeen en bevat vasculaire endotheelcellen, weefsel-residente immuuncellen, fibroblasten en populaties van adipocytenprecursorcellen (APC).

WAT is uitzonderlijk in zijn opmerkelijke vermogen om in omvang uit te breiden naarmate de vraag naar energieopslag toeneemt. Het handhaven van deze weefselplasticiteit is essentieel, aangezien een adequate opslag van lipiden in WAT beschermt tegen schadelijke ectopische lipideafzetting in niet-vetweefsels6. De manier waarop individuele WAT-depots deze expansie ondergaan als reactie op een calorieoverschot is een cruciale bepalende factor voor insulinegevoeligheid in de setting van obesitas7. Pathologische WAT-expansie, waargenomen bij zwaarlijvige personen met metabool syndroom, wordt gekenmerkt door preferentiële expansie van viscerale WAT-depots ten koste van metabolisch gunstig onderhuids vetweefsel. Bovendien wordt insulineresistentie bij obesitas in verband gebracht met pathologische remodellering van WAT. Dit wordt gekenmerkt door hypertrofische groei van bestaande adipocyten (toename in omvang), ontoereikende angiogenese, chronische metabole ontsteking, accumulatie van extracellulaire matrixcomponenten (fibrose) en weefselhypoxie 8,9. Deze WAT-fenotypes van obesitas worden geassocieerd met leversteatose en insulineresistentie, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen bij de aandoening van lipodystrofie (afwezigheid van functionele WAT). Daarentegen wordt gezonde WAT-expansie waargenomen in de metabolisch gezonde zwaarlijvige populatie en wordt gekenmerkt door preferentiële expansie van beschermende subcutane WAT en depot-expansie door adipocytenhyperplasie10. De rekrutering van nieuwe adipocyten wordt gemedieerd door de novo differentiatie van adipocyten uit adipocytenprecursorcellen (APC’s) (“adipogenese” genoemd). Hyperplasie van adipocyten valt samen met relatief lagere graden van WAT-fibrose en metabole ontsteking 6,11. Een veelheid aan celtypen binnen de WAT-micro-omgeving heeft een directe invloed op de gezondheid en uitbreidbaarheid van WAT bij obesitas12. Als zodanig blijft het definiëren van de functie van de verschillende celtypen die aanwezig zijn in WAT een hoge prioriteit voor het veld.

In het afgelopen decennium zijn verschillende strategieën gebruikt om inheemse APC’s te definiëren en te isoleren van menselijke en muizen WAT SVF13. Dergelijke strategieën isoleren APC’s op basis van de expressie van het celoppervlak van gemeenschappelijke mesenchymale stam-/voorlopercelmarkers met behulp van op antilichamen gebaseerde celscheidingstechnieken. Deze benaderingen omvatten fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), met behulp van fluorofoor-gelabelde antilichamen, of immunomagnetische parelscheiding (d.w.z. chemisch gemodificeerde antilichamen). Celoppervlakte-eiwitten die het doelwit zijn van de isolatie van APC’s zijn PDGFRα, PDGFRβ, CD34 en SCA-1. Deze benaderingen hebben bijgedragen aan de verrijking van APC’s; Celpopulaties geïsoleerd op basis van deze markers zijn echter vrij heterogeen. Zeer recente single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) studies hebben de moleculaire en functionele heterogeniteit van stromale cellen binnen de geïsoleerde stromale-vasculaire fractie (SVF) van muizen WAT 14,15,16,17 aan het licht gebracht. Op basis van onze eigen scRNA-seq en functionele analyses hebben we functioneel verschillende immuunmodulerende en adipogene PDGFRβ+ perivasculaire celsubpopulaties geïdentificeerd en gekarakteriseerd in het stromale compartiment van intra-abdominaal WAT bij volwassen muizen15. Fibro-inflammatoire precursoren, of FIP’s, vertegenwoordigen een prominente subpopulatie van PDGFRβ+-cellen en kunnen worden geïsoleerd op basis van LY6C-expressie (LY6C+ PDGFRβ+-cellen)15. FIP’s missen adipogene capaciteit, oefenen een sterke pro-inflammatoire reactie uit op verschillende stimuli, produceren collageen en scheiden anti-adipogene factorenaf 15. De pro-inflammatoire en fibrogene activiteit van deze cellen neemt toe in verband met obesitas bij muizen, wat impliceert dat deze cellen reguleren van WAT-remodellering. De LY6C-CD9-PDGFRβ+-subpopulatie vertegenwoordigt adipocytenprecursorcellen (APC’s). Deze APC’s zijn verrijkt door de expressie van Pparg en andere pro-adipogene genen, en differentiëren gemakkelijk tot rijpe adipocyten in vitro en in vivo15. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van deze verschillende celpopulaties uit intra-abdominale WAT-depots van volwassen muizen met behulp van FACS, en immunomagnetische parelscheiding met gebiotinyleerde antilichamen. Dit protocol kan worden gebruikt om functioneel verschillende subpopulaties van vetvoorlopercellen te isoleren van meerdere intra-abdominale WAT-depots van volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen15. Het afzonderlijk bestuderen van deze functioneel verschillende celpopulaties kan een grote bijdrage leveren aan ons huidige begrip van de moleculaire mechanismen die adipogenese en de remodellering van intra-abdominaal vetweefsel bij gezondheid en ziekte reguleren.

Het onderstaande protocol beschrijft de isolatie van vetvoorlopercellen van muizen epididymale WAT; dezelfde procedure kan echter worden gebruikt om overeenkomstige cellen te isoleren uit de mesenteriale en retroperitoneale WAT-depots van zowel mannelijke als vrouwelijke muizen15. Een gedetailleerd protocol over hoe deze depots bij muizen te identificeren en te isoleren is te vinden in Bagchi et al.18. Dit protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van muizen van 6-8 weken oud. De frequentie en het differentiatievermogen van APC’s kunnen afnemen in verband met veroudering.

Protocol

Alle protocollen en procedures voor dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Use and Care Committee van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas. 1. Isolatie van stromale vasculaire fractie (SVF) uit gonadale witte vetweefsel Ontleed het gonadale witte vetweefsel van muizen van 6-8 weken oud en plaats vetkussentjes in 1x PBS-oplossing. Combineer maximaal 4 vetdepots (2-4 depots van 1-2 muizen aanbevolen) en hak het weefsel fijn in een beker…

Representative Results

Dit protocol beschrijft twee strategieën die de isolatie van verschillende stromale celpopulaties uit intra-abdominale WAT-depots van volwassen muizen mogelijk maken. APC’s en FIP’s kunnen worden geïsoleerd door FACS (Figuur 1) of immunomagnetische parelscheiding met gebiotinyleerde antilichamen (Figuur 2). Beide benaderingen maken gebruik van reagentia en antilichamen die allemaal in de handel verkrijgbaar zijn. Immunomagnetische parelscheiding leidt tot de s…

Discussion

De C57BL/6-muizenstam is de meest gebruikte muizenstam in onderzoeken naar door voeding geïnduceerde obesitas. C57BL/6-muizen komen snel aan wanneer ze op een vetrijk dieet (HFD) worden geplaatst en ontwikkelen enkele van de prominente kenmerken van het metabool syndroom geassocieerd met obesitas (bijv. insulineresistentie en hyperlipidemie). Met name WAT-uitbreiding die optreedt in verband met voeding met een vetrijk dieet (HFD) vindt plaats op een depotspecifieke manier 19,20,21,22,23.</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs zijn Lisa Hansen en Kirsten Vestergaard dankbaar voor hun uitstekende technische assistentie, en P. Scherer, N. Joffin en C. Crewe voor het kritisch lezen van het manuscript. De auteurs bedanken de UTSW Flow Cytometry Core voor uitstekende begeleiding en hulp bij het ontwikkelen van de hier beschreven protocollen. R.K.G. wordt ondersteund door NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 en NIDDK R01 DK119163. J.P. wordt gesponsord door een pre-doctorale prijs van het Innovation Fund Denmark.

Materials

Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainers Fisher Scientific 352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific 21040CV
5ml polypropylene tubes Fisher Scientific 352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSS Sigma H8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.) Roche 11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.) Fisher Scientific BP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer) BioLegend 480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet) BioLegend 480019
100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads BioLegend 480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis Buffer eBioscience 00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32) eBioscience 553141
Antibodies
Biotin CD45 BioLegend 103103 Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: 30-F11
Biotin CD31 BioLegend 102503 Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MEC13.3
Biotin CD9 BioLegend 124803 Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MZ3
Biotin LY6C BioLegend 128003 Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5 BioLegend 102419 Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5 BioLegend 103131 Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PE BioLegend 136006 Concentration: Dilution 1:50
Species: Mouse
Clone: APB5
LY6C-APC BioLegend 128016 Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD9-FITC BioLegend 124808 Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucose Corning 10-014-CV
192 mL MCDB201 Sigma M6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024 Sigma 12303C
5 mL 100% ITS premix BD Bioscience 354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate Sigma A8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basic R&D systems 3139-FB-025/CF
5 mL Pen/Strep Corning 30-001-CI
500 µL Gentamycin Gibco 15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.

References

  1. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  4. Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
  5. Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
  6. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  7. Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
  8. Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).
  9. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  10. Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
  11. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  12. Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).
  13. Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
  14. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
  15. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636 (2018).
  16. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501 (2019).
  17. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
  18. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
  19. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
  20. Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
  21. Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
  22. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  23. Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861 (2018).
  24. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  25. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  26. Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
  27. Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).
  28. Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
  29. Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).

Play Video

Cite This Article
Peics, J., Vishvanath, L., Zhang, Q., Shan, B., Pedersen, T. Å., Gupta, R. K. Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots. J. Vis. Exp. (162), e61610, doi:10.3791/61610 (2020).

View Video