나노 물질 및 기타 어려운 물질의 조류 독성 테스트를위한 소규모 설정
Summary
우리는 LED로 수직으로 조명 된 설정을 사용하여 어려운 물질 (예 : 착색 물질 또는 나노 물질)에 대한 조류 독성 테스트를 시연합니다.
Abstract
생태 독성 데이터는 유럽 및 국제 규정(예: REACH)에 의한 화학물질의 사전 및 사후 시장 등록을 위한 요구 사항입니다. 조류 독성 검사는 화학 물질의 규제 위험 평가에 자주 사용됩니다. 높은 신뢰성과 재현성을 달성하기 위해서는 표준화된 가이드라인의 개발이 필수적입니다. 조류 독성 검사의 경우, 지침은 pH, 온도, 이산화탄소 수준 및 광 강도와 같은 매개 변수의 안정적이고 균일한 조건을 요구합니다. 나노 물질 및 기타 소위 어려운 물질은 그들의 규제 수용을 방해 하는 결과 큰 변화를 일으키는 빛을 방해할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 LEVITATT (조류 독성 검사를위한 LED 수직 조명 표)를 개발했습니다. 이 설정은 아래에서 LED 조명을 사용하여 균일한 광 분포 및 온도 제어를 허용하고 시료 내 의 그늘을 최소화합니다. 이 설정은 바이오매스 정량화를 위한 샘플 부피를 최적화하고 동시에 조류의 기하급수적인 성장을 지원하기 위해 CO2의 충분한 유입을 보장합니다. 또한, 테스트 컨테이너의 재료는 흡착 및 휘발화를 최소화하기 위해 맞춤화될 수 있습니다. 유색 물질 이나 입자 현탁액을 테스트 할 때, LED 조명의 사용은 또한 추가 열 발생없이 빛 강도를 증가 할 수 있습니다. 컴팩트한 설계와 최소한의 장비 요구 사항은 광범위한 실험실에서 LEVITATT구현 가능성을 높입니다. ALgal 독성 검사에 대한 표준화된 ISO 및 OECD 지침을 준수하는 반면, LEVITATT는 에렌마이어 플라스크 및 마이크로티터 플레이트에 비해 두 개의 기준 물질(3,5-디콜로로페놀 및 K2Cr2O7)과3개의 나노 물질(ZnO, CeO2및 BaSO4)에대한 낮은 샘플 간 가변성을 보였습니다.
Introduction
조류 독성 검사는 유럽 및 국제 규정에 의해 화학 물질의 사전 및 후 시장 등록에 필요한 생태 독성 데이터를 생성하는 데 사용되는 세 가지 필수 테스트 중 하나입니다 (예 : REACH1 및 TSCA (미국). 이를 위해 표준화된 조류 시험 지침은 국제기구(예: ISO 및 OECD)에 의해 개발되었습니다. 이러한 테스트 표준 및 지침은 pH, 온도, 이산화탄소 수준 및 광 강도 측면에서 이상적인 테스트 조건을 규정합니다. 그러나, 조류 시험 동안 안정적인 시험 상태를 유지하는 것은 실제로 어렵고 그 결과는 다양한 화학 물질 및 나노 물질(종종 “어려운 물질”이라고도 함)에 대한 재현성 및 신뢰성 문제로 고통받고있다. 기존의 조류 독성 테스트 설정의 대부분은 인큐베이터 내부의 궤도 셰이커에 위치한 상대적으로 큰 볼륨 (100-250 mL)으로 작동합니다. 이러한 설정은 시험 농도의 수를 제한하고 조류 배양 및 테스트 재료의 달성 가능하고 높은 볼륨을 복제합니다. 또한, 이러한 설정은 거의 균일 한 광장을 가지고 있으며 신뢰할 수있는 조명 조건은 또한 큰 플라스크에서 얻기 가 어렵고, 부분적으로 빛의 강도가 기하급수적으로 감소함에 따라 빛이 더 멀리 이동하고 부분적으로 플라스크 형상으로 인해. 대체 설정은 pH, 추가 바이오매스 측정, 안료 추출 또는 파괴적인 샘플링을 요구하는 기타 분석을 측정하기에 적절한 샘플링 볼륨을 허용하지 않는 작은 샘플 볼륨을 포함하는 플라스틱 마이크로티터3 플레이트로 구성됩니다. 유색현탁액을 형성하는 나노물질 및 물질의 조류 독성 검사를 위한 기존 설정을 사용하는 한 가지 특별한 과제는 종종 “차광”4,4,5라고도하는 조류 세포에 사용할 수 있는 빛의 간섭 또는 차단이다. 차광은 시험 물질과 조류 세포 사이의 시험 재료 및/또는 상호 작용에 의해 바이알 내에서 발생할 수 있으며, 또는 서로에 대한 위치와 광원에 대한 위치 때문에 바이알 사이에 차광이 발생할 수 있습니다.
이 방법은 OECD 2017,ISO 86928과 같은 표준에 따라 테스트를 허용하는 Arensberg 등6에 의해 도입된 소규모 조류 독성 테스트 설정을 기반으로 한다. 이 방법은 위에 명시된 한계를 해결하기 위해 더욱 최적화되어 있다: 1) 최소한의 열발생으로 균일한 조명 조건을 보장하기 위해 LED 조명 기술을 활용하고, 2) 일정한 pH, CO2 수준 및 3)를 유지하면서 화학/생물학적 분석을 위한 적절한 샘플 볼륨을 제공하여 휘발성 물질 또는 물질에 대한 테스트를 위한 다목적 테스트 컨테이너 재료를 사용할 수 있게 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Phytoplankton은 태양 에너지와 이산화탄소를 유기 물질로 변환하여 수중 생태계에서 중추적 인 역할을합니다. 이러한 이유로, 조류 성장 속도 억제 테스트는 화학 물질의 규제 위험 평가에 필요한 세 가지 필수 수생 독성 테스트 중 하나로 포함됩니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 조류 독성 검사를 수행하는 능력은 이 점에서 중요합니다. Erlenmeyer 플라스크를 사용한 테스트 설정은 도입에 설명된 바?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 순찰에 의해 투자되었다 – 나노 안전 테스트를위한 고급 도구, 호라이즌에서 보조금 계약 760813 호라이즌 에서 2020 연구 및 혁신 프로그램.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
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