Summary

Een kleinschalige setup voor algentoxiciteitstesten van nanomaterialen en andere moeilijke stoffen

Published: October 10, 2020
doi:

Summary

We demonstreren algentoxiciteitstests voor moeilijke stoffen (bijvoorbeeld gekleurde stoffen of nanomaterialen) met behulp van een opstelling die verticaal met een LED wordt verlicht.

Abstract

Ecotoxiciteitsgegevens zijn een vereiste voor pre- en post-market registratie van chemische stoffen door Europese en internationale regelgeving (bijvoorbeeld REACH). De algentoxiciteitstest wordt vaak gebruikt bij de beoordeling van de regelgeving van chemische stoffen. Om een hoge betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid te bereiken is de ontwikkeling van gestandaardiseerde richtlijnen van vitaal belang. Voor algentoxiciteitstests vereisen de richtlijnen stabiele en uniforme omstandigheden van parameters zoals pH, temperatuur, kooldioxideniveaus en lichtintensiteit. Nanomaterialen en andere zogenaamde moeilijke stoffen kunnen het licht verstoren, waardoor een grote variatie in verkregen resultaten de acceptatie van de regelgeving belemmert. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests) ontwikkeld. De setup maakt gebruik van LED-verlichting van onderen waardoor een homogene lichtverdeling en temperatuurregeling, terwijl ook het minimaliseren van intra-monster arcering. De opstelling optimaliseert het monstervolume voor biomassakwantificering en zorgt tegelijkertijd voor een voldoende instroom van CO2 om de exponentiële groei van de algen te ondersteunen. Bovendien kan het materiaal van de testcontainers worden aangepast om adsorptie en vervluchtiging te minimaliseren. Bij het testen van gekleurde stoffen of deeltjessuspensies, het gebruik van LED-verlichting maakt het ook mogelijk voor het verhogen van de lichtintensiteit zonder extra warmteopwekking. Het compacte ontwerp en de minimale apparatuurvereisten vergroten de mogelijkheden voor de implementatie van de LEVITATT in een breed scala aan laboratoria. Hoewel levitatt voldoet aan de gestandaardiseerde ISO- en OESO-richtlijnen voor algentoxiciteitstests, vertoonde het ook een lagere variabiliteit tussen de monsters voor twee referentiestoffen (3,5-Dicholorophenol en K2Cr2O7) en drie nanomaterialen (ZnO, CeO2en BaSO4) in vergelijking met Erlenmeyer-kolfjes en microtiterplaten.

Introduction

De algentoxiciteitstest is een van de slechts drie verplichte tests die worden gebruikt om de ecotoxiciteitsgegevens te genereren die nodig zijn voor de pre- en post-market registratie van chemische stoffen door Europese en internationale regelgeving (bijvoorbeeld REACH1 en TSCA (VS)). Hiervoor zijn gestandaardiseerde algentestrichtlijnen ontwikkeld door internationale organisaties (bijvoorbeeld ISO en OESO). Deze testnormen en richtlijnen schrijven ideale testomstandigheden voor in termen van pH, temperatuur, kooldioxideniveaus en lichtintensiteit. Het handhaven van stabiele testomstandigheden tijdens algentesten is in de praktijk echter moeilijk en de resultaten lijden aan problemen met reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid voor een reeks chemische stoffen en nanomaterialen (vaak aangeduid als “moeilijke stoffen”)2. De meeste van de bestaande algentoxiciteit testen setups werken met relatief grote volumes (100-250 mL) gelegen op een orbitale shaker in een incubator. Een dergelijke opstelling beperkt het aantal testconcentraties en repliceert haalbare en grote hoeveelheden algencultuur en testmateriaal. Bovendien hebben deze opstellingen zelden een uniform lichtveld en zijn de betrouwbare lichtomstandigheden bovendien moeilijk te verkrijgen in grote kolven, deels omdat de lichtintensiteit exponentieel afneemt naarmate het licht verder reist en deels door de kolfgeometrie. Alternatieve opstellingen omvatten kunststof microtiter3-platen met kleine monstervolumes die niet in staat zijn om voldoende bemonsteringsvolumes mogelijk te maken om pH, aanvullende biomassametingen, pigmentextractie of andere analyses die destructieve bemonstering vereisen, te meten. Een bijzondere uitdaging met behulp van bestaande opstellingen voor algentoxiciteit testen van nanomaterialen en stoffen die gekleurde suspensies vormen is de interferentie of het blokkeren van het licht beschikbaar voor de algencellen, vaak aangeduid als “arcering”4,5. Arcering kan optreden in flacons door het testmateriaal en/of interacties tussen het testmateriaal en de algencellen, of arcering kan optreden tussen flacons, vanwege hun positionering ten opzichte van elkaar en de lichtbron.

De methode is gebaseerd op de kleinschalige algentoxiciteitstest die Arensberg et al.6 heeft geïntroduceerd en die het mogelijk maakt om te testen in overeenstemming met normen zoals OESO 2017en ISO 86928. De methode is verder geoptimaliseerd om de hierboven genoemde beperkingen aan te pakken door: 1) gebruik te maken van de LED-lichttechnologie om uniforme lichtomstandigheden te garanderen met minimale warmteopwekking, 2) het verstrekken van voldoende monstervolume voor chemische / biologische analyse met behoud van constante pH, CO2 niveaus, en 3) waardoor het gebruik van veelzijdige testcontainer materiaal voor het testen van vluchtige stoffen of stoffen met een hoog sorptiepotentieel.

Protocol

1. Beschrijving van de LEVITATT-instelling Gebruik 20 mL scintillatie glazen flacons(figuur 1, insert 1) waardoor licht penetratie. Als alternatief kunnen lichte penetrable plastic flacons worden gebruikt. Kwantificeer de lichtintensiteit met behulp van een fotometer. Gebruik aan het begin van de test ten minste een testsuspensie van 4 mL om de kwantificering van biomassa mogelijk te maken en voor de karakterisering/kwantificering van nanomaterialen tijdens en na incubati…

Representative Results

Er wordt een eerste test met een referentiestof uitgevoerd om de gevoeligheid van de algenstam te bepalen. Referentiestoffen die regelmatig voor R. subcapitata worden gebruikt, zijn kaliumdichromaat en 3,5-Dichloodfenol7,8. Figuur 3 en tabel 2 laten een representatief resultaat zien van een algentest, met inbegrip van curvefitting en statistische output wanneer het DRC-pakket in R wordt toegepast op de groei…

Discussion

Fytoplankton zet zonne-energie en kooldioxide om in organisch materiaal en speelt daarmee een centrale rol in het aquatische ecosysteem. Om deze reden worden algengroeiremmingstests opgenomen als een van de drie verplichte aquatische toxiciteitstests die nodig zijn voor de wettelijke risicobeoordeling van chemische stoffen. De mogelijkheid om een betrouwbare en reproduceerbare algentoxiciteitstest uit te voeren is in dit verband essentieel. Testopstellingen met Erlenmeyer-kolven introduceert een reeks variabiliteiten en …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gefinancierd door PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 in het kader van horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich V179124
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134
BlueCap bottles (1L) Buch & Holm A/S  9072335
Boric acid Sigma-Aldrich B0394
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 208290
Clear acrylic sheet (40×40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 255599
Copper(II) chloride dihydrate Sigma-Aldrich 307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich  E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000 Hitachi
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 236489
LED light source Helmholt Elektronik A/S H35161 Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 221279
Orbital shaker IKA 2980200
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Raphidocelis subcapitata NORCCA NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL) Fisherscientific 11526325
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413
Sodium molybdate dihydrate Sigma-Aldrich 331058 
Spring clamp Frederiksen Scientific A/S 472002
Thermostatic cabinet VWR WTWA208450 Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm) Silvan 22605630165
Volumetric flasks (25 mL) DWK Life Sciences 246781455
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086

References

  1. European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
  2. Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
  3. Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
  4. Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
  5. Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
  6. Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
  7. Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
  8. International Organization for Standardization (ISO). Water Quality – Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
  9. Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
  10. Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
  11. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
  12. Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
  13. Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals – toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
  14. Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
  15. Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O’Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
  16. Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum–capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
  17. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
  18. Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
  19. Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
  20. Neale, P. A., Jaemting, A. K., O’Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
  21. Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
  22. Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
  23. Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
  24. Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).

Play Video

Cite This Article
Skjolding, L. M., Kruse, S., Sørensen, S. N., Hjorth, R., Baun, A. A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances. J. Vis. Exp. (164), e61209, doi:10.3791/61209 (2020).

View Video