Une configuration à petite échelle pour l’essai de toxicité des algues des nanomatériaux et autres substances difficiles
Summary
Nous démontrons des tests de toxicité des algues pour des substances difficiles (p. ex., substances colorées ou nanomatériaux) à l’aide d’une configuration éclairée verticalement par une LED.
Abstract
Les données sur l’écotoxicité sont une exigence pour l’enregistrement avant et après la mise sur le marché des produits chimiques par les réglementations européennes et internationales (p. ex., REACH). Le test de toxicité des algues est fréquemment utilisé dans l’évaluation des risques réglementaires des produits chimiques. Afin d’atteindre une fiabilité et une reproductibilité élevées, l’élaboration de lignes directrices normalisées est essentielle. Pour les essais de toxicité des algues, les lignes directrices exigent des conditions stables et uniformes de paramètres tels que le pH, la température, les niveaux de dioxyde de carbone et l’intensité lumineuse. Les nanomatériaux et autres substances dites difficiles peuvent interférer avec la lumière, ce qui entraîne une grande variation des résultats obtenus qui entravent leur acceptation réglementaire. Pour relever ces défis, nous avons développé LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). La configuration utilise l’éclairage LED d’en bas permettant une distribution homogène de la lumière et le contrôle de la température tout en minimisant l’ombrage intra-échantillon. La configuration optimise le volume de l’échantillon pour la quantification de la biomasse et assure en même temps un afflux suffisant de CO2 pour soutenir la croissance exponentielle des algues. En outre, le matériel des conteneurs d’essai peut être adapté pour minimiser l’adsorption et la volatilisation. Lors de l’essai de substances colorées ou de suspensions de particules, l’utilisation de lumières LED permet également d’augmenter l’intensité lumineuse sans production de chaleur supplémentaire. La conception compacte et les exigences minimales en matière d’équipement augmentent les possibilités de mise en œuvre du LEVITATT dans un large éventail de laboratoires. Bien qu’il soit conforme aux lignes directrices normalisées de l’ISO et de l’OCDE pour les tests de toxicité des algues, LEVITATT a également montré une variabilité interinstompale plus faible pour deux substances de référence (3,5-Dicholorophénol et K2Cr2O7) et trois nanomatériaux (ZnO, CeO2et BaSO4)par rapport aux flacons et plaques de microtiter Erlenmeyer.
Introduction
Le test de toxicité des algues est l’un des trois seuls tests obligatoires utilisés pour générer les données d’écotoxicité requises pour l’enregistrement des produits chimiques avant et après la mise sur le marché par les réglementations européennes et internationales (p. ex., REACH1 et TSCA (États-Unis)). À cette fin, des organisations internationales ont élaboré des lignes directrices normalisées sur les tests d’algues (p. ex., l’ISO et l’OCDE). Ces normes et lignes directrices prescrivent des conditions d’essai idéales en termes de pH, de température, de dioxyde de carbone et d’intensité lumineuse. Toutefois, le maintien de conditions d’essai stables pendant les essais d’algues est en pratique difficile et les résultats souffrent de problèmes de reproductibilité et de fiabilité pour une gamme de substances chimiques et de nanomatériaux (souvent appelés « ubstances difficile »)2. La plupart des installations existantes d’essais de toxicité des algues fonctionnent avec des volumes relativement importants (100–250 mL) situés sur un shaker orbital à l’intérieur d’un incubateur. Une telle configuration limite le nombre de concentrations d’essai et reproduit des volumes réalisables et élevés de culture d’algues et de matériel d’essai. En outre, ces configurations ont rarement un champ de lumière uniforme et des conditions d’éclairage fiables sont en outre difficiles à obtenir dans les grandes fioles, en partie parce que l’intensité lumineuse diminue exponentiellement plus la lumière se déplace et en partie en raison de la géométrie de la fiole. Les configurations alternatives comprennent des plaques de microtiter en plastique3 contenant de petits volumes d’échantillons qui ne permettent pas des volumes d’échantillonnage adéquats pour mesurer le pH, des mesures supplémentaires de la biomasse, l’extraction de pigments ou d’autres analyses nécessitant un échantillonnage destructeur. Un défi particulier utilisant les configurations existantes pour l’essai de toxicité des algues des nanomatériaux et des substances formant des suspensions colorées est l’interférence ou le blocage de la lumière disponible pour les cellules d’algues, souvent appelée « ombrage »4,5. L’ombrage peut se produire dans les flacons par le matériel d’essai et/ou les interactions entre le matériau d’essai et les cellules algales, ou l’ombrage peut se produire entre les flacons, en raison de leur positionnement les uns par rapport aux autres et de la source lumineuse.
La méthode est basée sur la configuration des essais de toxicité des algues à petite échelle introduit par Arensberg et al.6 qui permet de tester en conformité avec des normes telles que l’OCDE 2017, et ISO 86928. La méthode est en outre optimisée pour répondre aux limites indiquées ci-dessus par : 1) en utilisant la technologie de lumière DEL pour assurer des conditions lumineuses uniformes avec une production minimale de chaleur, 2) fournissant un volume d’échantillon adéquat pour l’analyse chimique/biologique tout en maintenant le pH constant, les niveaux de CO2, et 3) permettant l’utilisation de matériel polyvalent de récipient d’essai pour l’essai des substances volatiles ou des substances avec un potentiel de sorption élevé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le phytoplancton convertit l’énergie solaire et le dioxyde de carbone en matière organique et joue ainsi un rôle central dans l’écosystème aquatique. Pour cette raison, les tests d’inhibition du taux de croissance des algues sont inclus comme l’un des trois tests de toxicité aquatique obligatoires requis pour l’évaluation réglementaire des risques des produits chimiques. La capacité d’effectuer un test fiable et reproductible de toxicité des algues est essentielle à cet égard. Les configurations d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
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