Un'installazione su piccola scala per il test della tossicità delle alghe di nanomateriali e altre sostanze difficili
Summary
Dimostriamo test di tossicità delle alghe per sostanze difficili (ad esempio, sostanze colorate o nanomateriali) utilizzando un setup illuminato verticalmente con un LED.
Abstract
I dati sull’ecotossicità sono un requisito per la registrazione pre e post-mercato delle sostanze chimiche da parte delle normative europee e internazionali (ad esempio, REACH). Il test di tossicità delle alghe è spesso utilizzato nella valutazione del rischio normativo delle sostanze chimiche. Al fine di ottenere un’elevata affidabilità e riproducibilità, lo sviluppo di linee guida standardizzate è di vitale importanza. Per i test di tossicità delle alghe, le linee guida richiedono condizioni stabili e uniformi di parametri come pH, temperatura, livelli di anidride carbonica e intensità della luce. I nanomateriali e altre cosiddette sostanze difficili possono interferire con la luce causando una grande variazione nei risultati ottenuti ostacolando la loro accettazione normativa. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). L’installazione utilizza l’illuminazione a LED dal basso, consentendo una distribuzione omogenea della luce e il controllo della temperatura, riducendo al minimo l’ombreggiatura intra-campione. L’installazione ottimizza il volume del campione per la quantificazione della biomassa e allo stesso tempo garantisce un afflusso sufficiente di CO2 per supportare la crescita esponenziale delle alghe. Inoltre, il materiale dei contenitori di prova può essere adattato per ridurre al minimo l’assorbimento e la volatilizzazione. Durante la sperimentazione di sostanze colorate o sospensioni di particelle, l’uso di luci a LED consente anche di aumentare l’intensità della luce senza ulteriore generazione di calore. Il design compatto e i requisiti minimi di equipaggiamento aumentano le possibilità di implementazione del LEVITATT in una vasta gamma di laboratori. Pur essendo conforme alle linee guida standardizzate ISO e OCSE per i test di tossicità delle alghe, LEVITATT ha anche mostrato una minore variabilità tra campioni per due sostanze di riferimento (3,5-Dicholorophenol e K2Cr2O7) e tre nanomateriali (nO, CeO2e BaSO4) rispetto ai flaconi di Erlenmeyer e alle piastre microtitero.
Introduction
Il test di tossicità delle alghe è uno dei soli tre test obbligatori utilizzati per generare i dati di ecotossicità necessari per la registrazione pre e post-mercato di sostanze chimiche da parte delle normative europee e internazionali (ad esempio, REACH1 e TSCA (USA)). A tale scopo, le organizzazioni internazionali hanno sviluppato linee guida standardizzate per i test delle alghe (ad esempio, ISO e OCSE). Questi standard di test e linee guida prescrivono condizioni di prova ideali in termini di pH, temperatura, livelli di anidride carbonica e intensità della luce. Tuttavia, mantenere condizioni di prova stabili durante i test delle alghe è in pratica difficile e i risultati soffrono di problemi di riproducibilità e affidabilità per una serie di sostanze chimiche e nanomateriali (spesso indicati come “sostanze difficili”)2. La maggior parte delle configurazioni di test di tossicità delle alghe esistenti operano con volumi relativamente grandi (100-250 mL) situati su uno shaker orbitale all’interno di un’incubatrice. Tale impostazione limita il numero di concentrazioni di prova e replica volumi raggiungibili e elevati di coltura algale e materiale di prova. Inoltre, queste configurazioni raramente hanno un campo di luce uniforme e condizioni di illuminazione affidabili sono inoltre difficili da ottenere in grandi flaconi, in parte come l’intensità della luce diminuisce esponenzialmente più la luce viaggia e in parte a causa della geometria del fiasche. Le configurazioni alternative comprendono microtiter di plastica3 piastre contenenti piccoli volumi di campioni che non consentono volumi di campionamento adeguati per misurare il pH, misurazioni aggiuntive della biomassa, estrazione di pigmenti o altre analisi che richiedono un campionamento distruttivo. Una sfida particolare utilizzando le configurazioni esistenti per il test di tossicità algale di nanomateriali e sostanze che formano sospensioni colorate è l’interferenza o il blocco della luce disponibile per le cellule algali, spesso indicato come “ombreggiatura”4,5. L’ombreggiatura può verificarsi all’interno delle fiale dal materiale di prova e/o dalle interazioni tra il materiale di prova e le cellule algali, o l’ombreggiatura può verificarsi tra le fiale, a causa del loro posizionamento rispetto all’altro e della fonte di luce.
Il metodo si basa sull’impostazione del test di tossicità delle alghe su piccola scala introdotto da Arensberg et al.6 che consente di testare in conformità con standard quali OCSE 2017e ISO 86928. Il metodo è ulteriormente ottimizzato per affrontare le limitazioni sopra indicate da: 1) utilizzando la tecnologia della luce a LED per garantire condizioni di luce uniformi con una generazione minima di calore, 2) fornendo un volume campione adeguato per l’analisi chimico-biologica mantenendo costante il pH, i livelli di CO2 e 3) consentendo l’uso di materiale contenitore di prova versatile per la sperimentazione di sostanze volatili o sostanze con un elevato potenziale di assorbimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il fitoplancton converte l’energia solare e l’anidride carbonica in materia organica e detiene quindi un ruolo fondamentale nell’ecosistema acquatico. Per questo motivo, i test di inibizione del tasso di crescita delle alghe sono inclusi come uno dei tre test obbligatori di tossicità acquatica necessari per la valutazione del rischio regolamentare delle sostanze chimiche. La capacità di eseguire un test di tossicità algale affidabile e riproducibile è fondamentale a questo proposito. Le configurazioni di prova con fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata da PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 nell’ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
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