Summary

ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ

Published: October 10, 2020
doi:

Summary

LEDで垂直に照射されたセットアップを用いて、難しい物質(着色物質やナノ材料など)に対する藻類毒性試験を実証しています。

Abstract

エコ毒性データは、欧州および国際規制(REACHなど)による化学物質の市場前および市場後の登録の要件です。藻類毒性試験は、化学物質の規制リスク評価に頻繁に使用されます。高い信頼性と再現性を実現するためには、標準化されたガイドラインの開発が不可欠です。藻類毒性試験では、ガイドラインには、pH、温度、二酸化炭素レベル、光強度などのパラメータの安定した均一な条件が必要です。ナノ材料やその他のいわゆる難しい物質は、光を妨げ、その規制の受け入れを妨げる結果の大きな変動を引き起こす可能性があります。これらの課題に対処するために、我々は、LEVITATT(藻類毒性試験用LED垂直照明テーブル)を開発しました。このセットアップでは、下からのLED照明を利用して、均質な光の分布と温度制御を可能にする一方で、サンプル内シェーディングを最小限に抑えます。このセットアップは、バイオマス定量のためにサンプル量を最適化し、同時に藻類の指数成長をサポートするために十分なCO2流入を保証します。さらに、テスト容器の材料は吸着および揮発を最小にするように合わせることができる。着色物質や粒子懸濁液をテストする場合、LEDライトの使用はまた、追加の発熱なしに光強度を増加させることができます。コンパクトデザインと最小限の設備要件により、幅広い研究所でのLEVITATTの実装の可能性が高まります。また、藻類毒性試験の標準化されたISOおよびOECDガイドラインに準拠する一方で、LEVITATTは、エルレンマイヤーフラスコおよびマイクロタイタープレートと比較して、2つの基準物質(3,5-ジホロロフェノールおよびK2 Cr2O7)および3ナノ材料(ZnO、CeO2、およびBaSO4)に対して、より低いサンプル間変動性を示した。2

Introduction

藻類毒性試験は、欧州および国際的な規制(REACH1およびTSCA(米国)による化学物質の市場前および後の登録に必要な生態毒性データを生成するために使用される3つの必須試験のうちの1つです。このため、標準化された藻類試験ガイドラインは、国際機関(ISOおよびOECDなど)によって開発されています。これらの試験基準とガイドラインは、pH、温度、二酸化炭素レベルおよび光強度の点で理想的な試験条件を規定する。しかし、藻類試験中の安定した試験条件の維持は、実際には困難であり、その結果、化学物質やナノ材料(しばしば「難しい物質」と呼ばれる)の範囲に対する再現性と信頼性に関する問題に苦しむ2。既存の藻類毒性試験の設定のほとんどは、インキュベーター内の軌道シェーカー上に位置する比較的大量(100〜250 mL)で動作します。このようなセットアップは、テスト濃度の数を制限し、達成可能な、藻類培養物および試験材料の大量を複製します。さらに、これらの設定は、均一な光場を持つことはほとんどなく、信頼性の高い照明条件は、光強度が指数関数的に減少し、一部は、フラスコの形状に起因する一部として、大きなフラスコで得ることはさらに困難です。代替設定は、pH、追加のバイオマス測定、顔料抽出または破壊的なサンプリングを必要とする他の分析を測定するのに十分なサンプリング量を許容しない小さなサンプル量を含むプラスチックマイクロチター3プレートを含む。着色懸濁液を形成するナノ材料および物質の藻類毒性試験のための既存の設定を用いた特定の課題の1つは、藻類細胞に利用可能な光の干渉または遮断であり、しばしば「シェーディング」4,5,5と呼ばれる。シェーディングは、試験材料および/または試験材料と藻体細胞との間の相互作用によってバイアル内で発生する可能性があり、または互いに対する位置と光源のためにバイアル間でシェーディングが発生する可能性があります。

この方法は、OECD 2017、およびISO8692 8などの規格に準拠した試験を可能にする、アレンスバーグら6によって導入された小規模藻類毒性試験セットアップに基づいている。この方法は、上記の制限に対処するためにさらに最適化されています: 1)LED光技術を利用して最小限の発熱で均一な光条件を確保し、2)一定のpH、CO2レベル、および3)揮発性2物質の試験や高い被光電位を有する汎用性の高い試験容器材料の使用を可能にしながら、化学的/生物学的分析のための十分なサンプル量を提供する。

Protocol

1. LEVITATT 設定の説明 20 mLシンチレーションガラスバイアル(図1、挿入1)を使用して光の浸透を可能にします。あるいは、光貫通性プラスチックバイアルを使用することができます。光量計を使用して光強度を定量化します。 試験の開始時に少なくとも4 mLの試験懸濁液を使用して、バイオマスの定量化とインキュベーション中およびインキュベーション後?…

Representative Results

基準物質を用いた初期試験を行い、藻類株の感度を判定する。R.サブペタに定期的に使用される基準物質は、ジクロメートカリウムおよび3,5-ジクロルフェノール77,88である。図3および表2は、R中のDRCパッケージが成長率に適用された場合の曲線適合および統計出力を含む藻類試験の代表的な結果を示す。…

Discussion

植物プランクトンは太陽エネルギーと二酸化炭素を有機物に変換し、水生生態系において極めて重要な役割を果たしています。このため、藻類増殖率阻害試験は、化学物質の規制リスク評価に必要な3つの必須の水生毒性試験の1つとして含まれています。信頼性が高く再現可能な藻類毒性試験を行う能力は、この点において重要です。アーレンマイヤーフラスコを使用したテスト設定では、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、Horizon 2020の研究およびイノベーションプログラムの下で、PATROLS – ナノセーフティテストのための高度なツール、グラント契約760813によって資金提供されました。

Materials

Acetone Sigma-Aldrich V179124
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134
BlueCap bottles (1L) Buch & Holm A/S  9072335
Boric acid Sigma-Aldrich B0394
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 208290
Clear acrylic sheet (40×40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 255599
Copper(II) chloride dihydrate Sigma-Aldrich 307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich  E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000 Hitachi
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 236489
LED light source Helmholt Elektronik A/S H35161 Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 221279
Orbital shaker IKA 2980200
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Raphidocelis subcapitata NORCCA NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL) Fisherscientific 11526325
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413
Sodium molybdate dihydrate Sigma-Aldrich 331058 
Spring clamp Frederiksen Scientific A/S 472002
Thermostatic cabinet VWR WTWA208450 Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm) Silvan 22605630165
Volumetric flasks (25 mL) DWK Life Sciences 246781455
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086

References

  1. European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
  2. Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
  3. Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
  4. Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
  5. Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
  6. Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
  7. Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
  8. International Organization for Standardization (ISO). Water Quality – Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
  9. Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
  10. Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
  11. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
  12. Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
  13. Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals – toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
  14. Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
  15. Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O’Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
  16. Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum–capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
  17. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
  18. Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
  19. Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
  20. Neale, P. A., Jaemting, A. K., O’Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
  21. Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
  22. Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
  23. Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
  24. Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).

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Cite This Article
Skjolding, L. M., Kruse, S., Sørensen, S. N., Hjorth, R., Baun, A. A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances. J. Vis. Exp. (164), e61209, doi:10.3791/61209 (2020).

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