Summary

Bakteriyel Keratite Karşı İlaç Tedavilerini İncelemek İçin Porcine Ex Vivo Kornea Modeli Kurulması

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

Bu makalede, bakteriyel keratitin ex vivo porcine modelini kurmak için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Pseudomonas aeruginosa prototipik bir organizma olarak kullanılır. Bu yenilikçi model in vivo enfeksiyonu taklit eder, çünkü bakteri çoğalması bakterinin kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlıdır.

Abstract

Yeni antimikrobiyaller geliştirirken, hayvan deneylerinin başarısı in vitro testlerden in vivo hayvan enfeksiyonlarına kadar antimikrobiyal etkinliğin doğru bir şekilde tahmin edilmesine bağlıdır. Mevcut in vitro testler tipik olarak antimikrobiyal etkinliği abartır, çünkü bir difüzyon bariyeri olarak konak dokusunun varlığı hesaba katmaz. Bu darboğazın üstesinden gelmek için, prototipik bir organizma olarak Pseudomonas aeruginosa kullanarak bakteriyel keratitin ex vivo porcine kornea modelini geliştirdik. Bu makalede, porcine korneasının hazırlanması ve enfeksiyonun kurulması için protokol açıklanmaktadır. ısmarlama cam kalıplar, enfeksiyon çalışmaları için korneanın basit kurulumunu sağlar. Bakteriyel çoğalma kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlı olduğu için model in vivo enfeksiyonu taklit eder. Enfeksiyonun kurulması, uygun plaka sayımları ile değerlendirilen koloni oluşturan birimlerin sayısında bir artış olarak doğrulanır. Sonuçlar, burada açıklanan yöntem kullanılarak ex vivo kornealarda enfeksiyonun oldukça tekrarlanabilir bir şekilde kurulabileceğini göstermektedir. Model gelecekte P. aeruginosadışındaki mikroorganizmaların neden olduğu keratitleri taklit etmek için genişletilebilir. Modelin nihai amacı, in vivo enfeksiyonları daha fazla temsil eden bir senaryoda antimikrobiyal kemoterapinin bakteriyel enfeksiyonun ilerlemesi üzerindeki etkisini araştırmaktır. Bunu yaparken, burada açıklanan model, hayvanların test için kullanımını azaltacak, klinik çalışmalarda başarı oranlarını artıracak ve sonuçta yeni antimikrobiyallerin kliniğe hızlı bir şekilde çevrilmesini sağlayacaktır.

Introduction

Kornea enfeksiyonları körlüğün önemli nedenleridir ve düşük ve orta gelirli ülkelerde salgın oranlarında ortaya çıkar. Hastalığın etiyolojisi bölgeden bölgeye değişmekle birlikte bakteriler bu vakaların büyük bir çoğunluğunu oluşturmektedir. Pseudomonas aeruginosa, hızla ilerleyen bir hastalığa neden olan önemli bir patojendir. Çoğu durumda, hastalar stromal skar, düzensiz astigmatizma ile bırakılır, nakil gerektirir veya en kötü senaryoda, bir göz kaybeder1,2.

P. aeruginosa’nın neden olduğu bakteriyel keratit, özellikle P. aeruginosa’nın antimikrobiyal dirençli suşlarının artan ortaya çıkması nedeniyle tedavisi zor birgöz enfeksiyonudur. Son on yıl içinde, genel olarak kornea enfeksiyonları ve pseudomonas sp.’nin neden olduğu testler ve yeni tedaviler geliştirmek, antibiyotik direncindeki mevcut eğilimle mücadele etmek için gerekli olduğu ortaya çıktı3.

Kornea enfeksiyonları için yeni tedavilerin etkinliğini test etmek için, geleneksel in vitro mikrobiyolojik yöntemler, laboratuvar kültürü sırasında ve in vivo enfeksiyonlar sırasında bakteriyel fizyolojinin farklılığı ve konak arayüzünün olmaması nedeniyle zayıf bir vekildir4,5. Bununla birlikte, in vivo hayvan modelleri pahalıdır, zaman alıcıdır, sadece az sayıda çoğaltma sağlayabilir ve hayvan refahı konusunda endişeleri artırabilir.

Bu yazıda, akut ve kronik enfeksiyonlar için çeşitli tedavileri test etmek için kullanılabilecek basit ve tekrarlanabilir bir organotipik ex vivo porcine keratit modeli göstermektedir. Bu deney için P. aeruginosa’yı kullandık, ancak model diğer bakteriler ve keratite neden olan mantar ve maya gibi organizmalarla da iyi çalışıyor.

Protocol

Albino laboratuvar tavşanları, ev ofisi onaylı protokoller altında planlanan diğer deneysel çalışmalar için laboratuvarda feda edildi. Bu çalışmalarda deneysel kullanım için gözler gerekli değildi, bu yüzden bu protokol için kullanıldılar. 1. Sterilizasyon KRİtİk ADIM: Distel’in %5 (v/v) çözeltisinde 1 saat boyunca damıtılarak tüm forsepsleri ve makasları dezenfekte edin, fırçayla temizleyin, musluk suyuyla durulayın ve 185 °C’de bir fırında minimum …

Representative Results

Cam kalıpların tasarımı, kullanımı modeli kontaminasyonla ilgili minimum / hiç sorun olmadan tutarlı bir şekilde kurmamızı sağlayan yenilikçi ve orijinal bir fikirdir. Kalıplar Sheffield Üniversitesi’nde bir cam üfleyici tarafından bir tasarıma dayanarak hazırlanmıştır (Şekil 1A). Deneysel kurulum korneanın dışbükey şeklini korur ve enfeksiyonun gerçekleştiği epitelin üstünde bakteri tutar (Şekil 1B). <p class="jove_content"…

Discussion

Ex vivo porcine kornea kullanılarak bu keratit modelinin geliştirilmesinin arkasındaki ana sürücü, preklinik aşamalarda antimikrobiyal etkinliği daha doğru bir şekilde belirlemek için yeni antimikrobiyaller geliştiren araştırmacılara temsili bir in vitro model sağlamaktır. Bu, yeni antimikrobiyallerin klinik öncesi aşamalarda ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrol geliştirmesine, klinik çalışmalarda başarıyı artırmasına, hedeflenen çalışmalara olanak sağlayarak hayv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Chesterfield’daki Elliot Abattoir’e gözenekli gözler sağladığı için teşekkür etmek istiyor. Cam halkalar, Sheffield Üniversitesi Kimya Bölümü’nden cam üfleyici Dan Jackson tarafından tasarımımıza dayanarak yapıldı. Yazarlar, tıbbi araştırma konseyine (MR/S004688/1) finansman için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Kornea hazırlamada teknik yardım için Bayan Shanali Dikwella’ya teşekkür etmek istiyor. Yazarlar, resimleri biçimlendirme konusunda yardımcı olduğu için Bay Jonathan Emery’ye teşekkür etmek istiyor.

Materials

50 mL Falcon tube SLS 352070
Amphotericin B Sigma A2942
Cellstar 12 well plate Greiner Bio-One 665180
Dextran Sigma 31425-100mg-F
Distel Fisher Scientific 12899357
DMEM + glutamax SLS D0819
Dual Oven Incubator SLS OVe1020 Sterilising oven
Epidermal growth factor SLS E5036-200UG
F12 HAM Sigma N4888
Foetal calf serum Labtech International CA-115/500
Forceps Fisher Scientific 15307805
Handheld homogeniser 220 Fisher Scientific 15575809 Homogeniser
Heracell VIOS 160i Thermo Scientific 15373212 Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R VWR 521-2242 Centrifuge
Insulin, recombinant Human SLS 91077C-1G
LB agar Sigma L2897
Multitron Infors Not appplicable Bacterial incubator
PBS SLS P4417
Penicillin-Streptomycin SLS P0781
Petri dish Fisher Scientific 12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne Starlab CC7672-3340
Povidone iodine Weldricks pharmacy 2122828
Safe 2020 Fisher Scientific 1284804 Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15 Fisher Scientific O305
Scalpel Swann Morton Fisher Scientific 11849002

References

  1. Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
  2. Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
  3. Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
  4. Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
  5. Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
  6. Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
  7. Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
  8. Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
  9. Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
  10. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
  11. Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
  12. Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  13. Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
  14. Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  15. Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
  16. Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
  17. Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
  18. Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).

Play Video

Cite This Article
Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., Partridge, L., Garg, P., MacNeil, S., Monk, P. N., Karunakaran, E. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp. (159), e61156, doi:10.3791/61156 (2020).

View Video