Summary

Establecer un modelo de córnea ex vivo porcina para estudiar tratamientos farmacológicos contra la queratitis bacteriana

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

Este artículo describe un protocolo paso a paso para establecer un modelo ex vivo porcino de queratitis bacteriana. Pseudomonas aeruginosa se utiliza como organismo prototípico. Este modelo innovador imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal.

Abstract

Al desarrollar nuevos antimicrobianos, el éxito de los ensayos con animales depende de la extrapolación precisa de la eficacia antimicrobiana de las pruebas in vitro a las infecciones animales in vivo. Las pruebas in vitro existentes suelen sobreestimar la eficacia antimicrobiana, ya que no se tiene en cuenta la presencia de tejido huésped como barrera de difusión. Para superar este cuello de botella, hemos desarrollado un modelo corneal porcino ex vivo de queratitis bacteriana utilizando Pseudomonas aeruginosa como organismo prototípico. Este artículo describe la preparación de la córnea porcina y el protocolo para el establecimiento de la infección. Los moldes de vidrio a medida permiten una configuración sencilla de la córnea para estudios de infección. El modelo imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal. El establecimiento de la infección se verifica como un aumento en el número de unidades formadoras de colonias evaluadas a través de recuentos de placas viables. Los resultados demuestran que la infección se puede establecer de una manera altamente reproducible en las córneas ex vivo utilizando el método descrito aquí. El modelo se puede extender en el futuro para imitar la queratitis causada por microorganismos distintos de P. aeruginosa. El objetivo final del modelo es investigar el efecto de la quimioterapia antimicrobiana en el progreso de la infección bacteriana en un escenario más representativo de las infecciones in vivo. Al hacerlo, el modelo descrito aquí reducirá el uso de animales para las pruebas, mejorará las tasas de éxito en los ensayos clínicos y, en última instancia, permitirá la traducción rápida de nuevos antimicrobianos a la clínica.

Introduction

Las infecciones corneales son causas importantes de ceguera y se producen en proporciones epidémicas en los países de ingresos bajos y medianos. La etiología de la enfermedad varía de una región a otra, pero las bacterias representan la gran mayoría de estos casos. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno importante que causa una enfermedad rápidamente progresiva. En muchos casos, los pacientes se quedan con cicatrices estromales, astigmatismo irregular, requieren trasplante o en el peor de los casos, pierden un ojo1,2.

La queratitis bacteriana causada por P. aeruginosa es una infección ocular difícil de tratar particularmente debido a la creciente aparición de cepas resistentes a los antimicrobianos de P. aeruginosa. En la última década, se ha hecho evidente que las pruebas y el desarrollo de nuevos tratamientos para las infecciones corneales, en general, y los causados por Pseudomonas sp., en particular, son esenciales para combatir la tendencia actual en la resistencia a los antibióticos3.

Para la prueba de la eficacia de nuevos tratamientos para infecciones corneales, los métodos microbiológicos in vitro convencionales son un sustituto pobre debido a la diferencia en la fisiología bacteriana durante el cultivo de laboratorio y durante las infecciones in vivo, así como debido a la falta de la interfaz huésped4,5. Los modelos animales in vivo, sin embargo, son caros, que consumen mucho tiempo, sólo pueden ofrecer un pequeño número de réplicas y plantear preocupaciones sobre el bienestar animal.

En este artículo, demostramos un modelo de queratitis orgánica ex vivo organotípica simple y reproducible que se puede utilizar para probar varios tratamientos para infecciones agudas y crónicas. Hemos utilizado P. aeruginosa para este experimento, pero el modelo también funciona bien con otras bacterias, y organismos como hongos y levaduras que causan queratitis.

Protocol

Los conejos de laboratorio albino fueron sacrificados en el laboratorio para otros trabajos experimentales planificados bajo protocolos aprobados por el ministerio del interior. Los ojos no eran necesarios para su uso experimental en esos estudios, por lo que se utilizaron para este protocolo. 1. Esterilización PASO CRÍTICO: Desinfectar todas las fórceps y tijeras remojando durante 1 h en 5% (v/v) solución de Distel en agua destilada, limpiar con un cepillo, enjuagar con agua del…

Representative Results

El diseño de los moldes de vidrio es una idea innovadora y original, cuyo uso nos permitió configurar el modelo de una manera consistente con problemas mínimos/nulos con la contaminación. Los moldes fueron preparados por un soplador de vidrio en la Universidad de Sheffield basado en un diseño(Figura 1A). La configuración experimental mantiene la forma convexa de la córnea y mantiene bacterias en la parte superior del epitelio donde se produce la infección (Figura…

Discussion

El principal impulsor del desarrollo de este modelo de queratitis utilizando córnea porcina ex vivo es proporcionar a los investigadores el desarrollo de nuevos antimicrobianos con un modelo in vitro representativo para determinar con mayor precisión la eficacia antimicrobiana en las etapas preclínicas. Esto proporcionará a los investigadores involucrados en el desarrollo de nuevos antimicrobianos un mayor control sobre el diseño y la formulación de fármacos en las etapas preclínicos, aumentar el éxito en los en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores quieren agradecer a Elliot Abattoir en Chesterfield por proporcionar ojos porcinos. Los anillos de vidrio fueron hechos basados en nuestro diseño por el soplador de vidrio Dan Jackson del Departamento de Química de la Universidad de Sheffield. Los autores quisieran agradecer al Consejo de Investigación Médica (MR/S004688/1) la financiación. Los autores también quieren agradecer a la Sra. Shanali Dikwella su ayuda técnica con la preparación de la córnea. Los autores quieren agradecer al Sr. Jonathan Emery la ayuda para dar formato a las imágenes.

Materials

50 mL Falcon tube SLS 352070
Amphotericin B Sigma A2942
Cellstar 12 well plate Greiner Bio-One 665180
Dextran Sigma 31425-100mg-F
Distel Fisher Scientific 12899357
DMEM + glutamax SLS D0819
Dual Oven Incubator SLS OVe1020 Sterilising oven
Epidermal growth factor SLS E5036-200UG
F12 HAM Sigma N4888
Foetal calf serum Labtech International CA-115/500
Forceps Fisher Scientific 15307805
Handheld homogeniser 220 Fisher Scientific 15575809 Homogeniser
Heracell VIOS 160i Thermo Scientific 15373212 Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R VWR 521-2242 Centrifuge
Insulin, recombinant Human SLS 91077C-1G
LB agar Sigma L2897
Multitron Infors Not appplicable Bacterial incubator
PBS SLS P4417
Penicillin-Streptomycin SLS P0781
Petri dish Fisher Scientific 12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne Starlab CC7672-3340
Povidone iodine Weldricks pharmacy 2122828
Safe 2020 Fisher Scientific 1284804 Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15 Fisher Scientific O305
Scalpel Swann Morton Fisher Scientific 11849002

References

  1. Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
  2. Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
  3. Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
  4. Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
  5. Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
  6. Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
  7. Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
  8. Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
  9. Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
  10. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
  11. Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
  12. Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  13. Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
  14. Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  15. Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
  16. Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
  17. Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
  18. Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).

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Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., Partridge, L., Garg, P., MacNeil, S., Monk, P. N., Karunakaran, E. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp. (159), e61156, doi:10.3791/61156 (2020).

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