Estabelecendo um modelo de córnea porcina ex vivo para estudar tratamentos medicamentosos contra ceratite bacteriana

Summary

Este artigo descreve um protocolo passo a passo para criar um modelo de ceratite porcina ex vivo de ceratite bacteriana. Pseudomonas aeruginosa é usado como organismo prototípico. Este modelo inovador imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea.

Abstract

Ao desenvolver novos antimicrobianos, o sucesso dos ensaios em animais depende da extrapolação precisa da eficácia antimicrobiana de testes in vitro a infecções em animais in vivo. Os testes in vitro existentes tipicamente superestimam a eficácia antimicrobiana, pois a presença de tecido hospedeiro como barreira de difusão não é contabilizada. Para superar esse gargalo, desenvolvemos um modelo de ceratite bacteriana ex vivo porcina usando Pseudomonas aeruginosa como organismo prototipado. Este artigo descreve a preparação da córnea suína e o protocolo para o estabelecimento da infecção. Moldes de vidro sob medida permitem a configuração direta da córnea para estudos de infecção. O modelo imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea. O estabelecimento da infecção é verificado como um aumento no número de unidades formadoras de colônias avaliadas por meio de placas viáveis. Os resultados demonstram que a infecção pode ser estabelecida de forma altamente reprodutível nas córneas ex vivo usando o método descrito aqui. O modelo pode ser estendido no futuro para imitar ceratite causada por microrganismos diferentes de P. aeruginosa. O objetivo final do modelo é investigar o efeito da quimioterapia antimicrobiana no progresso da infecção bacteriana em um cenário mais representativo de infecções in vivo. Ao fazê-lo, o modelo descrito aqui reduzirá o uso de animais para testes, melhorará as taxas de sucesso em ensaios clínicos e, finalmente, permitirá a tradução rápida de novos antimicrobianos para a clínica.

Introduction

As infecções corneais são importantes causas de cegueira e ocorrem em proporções epidêmicas em países de baixa e média renda. A etiologia da doença varia de região para região, mas as bactérias são responsáveis pela grande maioria desses casos. Pseudomonas aeruginosa é um patógeno importante que causa uma doença rapidamente progressiva. Em muitos casos, os pacientes ficam com cicatrizes estromais, astigmatismo irregular, necessitam de transplante ou, no pior dos casos, perdem um olho^1,2.

A ceratite bacteriana causada pela P. aeruginosa é uma infecção ocular difícil de tratar particularmente devido ao crescente surgimento de cepas resistentes antimicrobianas de P. aeruginosa. Na última década, tornou-se evidente que testar e desenvolver novos tratamentos para infecções córneas, em geral, e aqueles causados por Pseudomonas sp., em particular, são essenciais para combater a tendência atual de resistência a antibióticos³.

Para testar a eficácia de novos tratamentos para infecções córneas, os métodos microbiológicos in vitro convencionais são um substituto ruim devido à diferença na fisiologia bacteriana durante a cultura laboratorial e durante infecções in vivo, bem como devido à falta da interface hospedeira^4,5. Os modelos in vivo animal, no entanto, são caros, demorados, só podem entregar um pequeno número de réplicas e levantar preocupações sobre o bem-estar animal.

Neste artigo, demonstramos um modelo simples e reprodutível organotípico ex vivo porcina de ceratite que pode ser usado para testar vários tratamentos para infecções agudas e crônicas. Usamos P. aeruginosa para este experimento, mas o modelo também funciona bem com outras bactérias, e organismos como fungos e leveduras que causam ceratite.

Protocol

Coelhos do laboratório albino foram sacrificados em laboratório por outros trabalhos experimentais planejados sob protocolos aprovados pelo home office. Os olhos não eram necessários para uso experimental nesses estudos, por isso foram utilizados para este protocolo. 1. Esterilização PASSO CRÍTICO: Desinfete todos os fórceps e tesouras de molho por 1h em 5% (v/v) solução de Distel em água destilada, limpe com escova, enxágue com água da torneira e esterilize em forno a 1…

Representative Results

O design dos moldes de vidro é uma ideia inovadora e original, sendo que o uso nos permitiu configurar o modelo de forma consistente com problemas mínimos/sem contaminação. Os moldes foram preparados por um soprador de vidro na Universidade de Sheffield com base em um design (Figura 1A). A configuração experimental mantém a forma convexa da córnea e mantém bactérias no topo do epitélio onde ocorre a infecção(Figura 1B). C…

Discussion

O principal motor por trás do desenvolvimento deste modelo de ceratite usando córnea porcina ex vivo é fornecer aos pesquisadores que desenvolvem novos antimicrobianos com um modelo in vitro representativo para determinar com mais precisão a eficácia antimicrobiana nos estágios pré-clínicos. Isso fornecerá aos pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de novos antimicrobianos maior controle sobre o design e formulação de medicamentos nos estágios pré-clínicos, aumentará o sucesso em ensaios clínicos, re…

Materials

50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002