Summary

إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد نموذج مُنَقَر vivo السابقين من التهاب القرنية البكتيري. يستخدم Pseudomonas aeruginosa ككائن اضروبي. هذا النموذج المبتكر يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية.

Abstract

عند تطوير مضادات الميكروبات الجديدة ، يعتمد نجاح التجارب الحيوانية على استقراء دقيق لنجاعة مضادات الميكروبات من الاختبارات المختبرية إلى العدوى الحيوانية في الجسم الحي. وعادة ما تبالغ الاختبارات المختبرية الموجودة في تقدير فعالية مضادات الميكروبات لأن وجود الأنسجة المضيفة كحاجز للنشر لا يُحَدَّد. للتغلب على هذا عنق الزجاجة، قمنا بتطوير نموذج القرنية السابق vivo porecine من التهاب القرنية البكتيري باستخدام Pseudomonas aeruginosa ككائن حي نموذجي. توضح هذه المقالة إعداد القرنية بورسين والبروتوكول لإنشاء العدوى. قوالب الزجاج مفصل تمكين الإعداد مباشرة من القرنية لدراسات العدوى. نموذج يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية. يتم التحقق من إنشاء العدوى كزدّة في عدد وحدات تشكيل المستعمرة التي تم تقييمها عبر عد الصفائح القابلة للتطبيق. النتائج تثبت أنه يمكن أن تنشأ العدوى بطريقة استنساخها للغاية في القرنيات السابقين vivo باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. ويمكن توسيع النموذج في المستقبل لتقليد التهاب القرنية الناجم عن الكائنات الحية الدقيقة غير P. aeruginosa. الهدف النهائي من هذا النموذج هو التحقيق في تأثير العلاج الكيميائي المضاد للميكروبات على تقدم العدوى البكتيرية في سيناريو أكثر تمثيلاً في العدوى الجسمية. وبذلك، فإن النموذج الموصوف هنا سيقلل من استخدام الحيوانات للاختبار، ويحسن معدلات النجاح في التجارب السريرية، وفي نهاية المطاف سيمكن من الترجمة السريعة لمضادات الميكروبات الجديدة إلى العيادة.

Introduction

31 – تعد عدوى القرنية من الأسباب الهامة للعمى، وتحدث بنسب وبائية في البلدان المنخفضة الدخل والبلدان المتوسطة الدخل. وتختلف مسببات المرض من منطقة إلى أخرى ولكن البكتيريا تمثل أغلبية كبيرة من هذه الحالات. Pseudomonas aeruginosa هو الممرض المهم الذي يسبب مرض تقدمية بسرعة. في كثير من الحالات، ويترك المرضى مع تندب stromal، الاستجماتيزم غير النظامية، تتطلب زرع أو في أسوأ سيناريو، تفقد العين1،2.

التهاب القرنية البكتيرية الناجمة عن P. aeruginosa هو عدوى العين صعبة لعلاج خاصة بسبب الظهور المتزايد لسلالات مقاومة مضادات الميكروبات من P. aeruginosa. خلال العقد الماضي، أصبح من الواضح أن اختبار وتطوير علاجات جديدة لالتهابات القرنية، بشكل عام، وتلك التي تسببها Pseudomonas sp.، على وجه الخصوص، ضرورية لمكافحة الاتجاه الحالي في مقاومة المضادات الحيوية3.

لاختبار فعالية العلاجات الجديدة لالتهابات القرنية ، والأساليب التقليدية في المختبرات الميكروبيولوجية هي بديل الفقراء بسبب الفرق في علم وظائف الأعضاء البكتيرية خلال الثقافة المختبرية ، وخلال الالتهابات في الجسم الحي وكذلك بسبب عدم وجود واجهة المضيف4،5. في نماذج الحيوانات الحية، ومع ذلك، هي مكلفة، تستغرق وقتا طويلا، لا يمكن إلا أن تقديم عدد قليل من النسخ المتماثلة وإثارة المخاوف بشأن رعاية الحيوان.

في هذه المقالة، ونحن نبرهن على بسيطة وقابلة للاستنساخ organotypic السابقين vivo porcine نموذج من التهاب القرنية التي يمكن استخدامها لاختبار العلاجات المختلفة للعدوى الحادة والمزمنة. لقد استخدمنا P. aeruginosa لهذه التجربة ولكن النموذج يعمل أيضا بشكل جيد مع البكتيريا الأخرى، والكائنات الحية مثل الفطريات والخميرة التي تسبب التهاب القرنية.

Protocol

تم التضحية بالأرانب مختبر ألبينو في المختبر من أجل غيرها من الأعمال التجريبية المخطط لها في إطار بروتوكولات وزارة الداخلية المعتمدة. لم تكن العيون مطلوبة للاستخدام التجريبي في تلك الدراسات لذلك تم استخدامها لهذا البروتوكول. 1- التعقيم الخطوة الحرجة: تطهير جميع ملقط و?…

Representative Results

تصميم القوالب الزجاجية هي فكرة مبتكرة ومبتكرة، واستخدام التي سمحت لنا لاقامة نموذج بطريقة متسقة مع الحد الأدنى / لا قضايا التلوث. تم إعداد قوالب من قبل منفاخ الزجاج في جامعة شيفيلد على أساس تصميم (الشكل 1A). الإعداد التجريبي يحافظ على شكل محدب للقرنية ويحمل البكتيريا على الج…

Discussion

المحرك الرئيسي وراء تطوير هذا النموذج التهاب القرنية باستخدام القرنية السابقين vivo porcine هو تزويد الباحثين النامية مضادات الميكروبات الجديدة مع نموذج تمثيلي في المختبر لتحديد فعالية مضادات الميكروبات بدقة أكبر في المراحل قبل الظهر. وهذا سيوفر للباحثين المشاركين في تطوير مضادات الميكروبا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب يود أن أشكر إليوت Abattoir في تشيسترفيلد لتوفير عيون porcine. تم صنع الخواتم الزجاجية بناء على تصميمنا من قبل منفاخ الزجاج دان جاكسون من قسم الكيمياء في جامعة شيفيلد. ويود المؤلفون أن يشكروا مجلس البحوث الطبية (MR/S004688/1) على التمويل. كما يود أصحاب البلاغ أن يشكروا السيدة شانالي ديكويلا على مساعدتها التقنية في إعداد القرنية. الكتاب يود أن أشكر السيد جوناثان إيمري للمساعدة في تنسيق الصور.

Materials

50 mL Falcon tube SLS 352070
Amphotericin B Sigma A2942
Cellstar 12 well plate Greiner Bio-One 665180
Dextran Sigma 31425-100mg-F
Distel Fisher Scientific 12899357
DMEM + glutamax SLS D0819
Dual Oven Incubator SLS OVe1020 Sterilising oven
Epidermal growth factor SLS E5036-200UG
F12 HAM Sigma N4888
Foetal calf serum Labtech International CA-115/500
Forceps Fisher Scientific 15307805
Handheld homogeniser 220 Fisher Scientific 15575809 Homogeniser
Heracell VIOS 160i Thermo Scientific 15373212 Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R VWR 521-2242 Centrifuge
Insulin, recombinant Human SLS 91077C-1G
LB agar Sigma L2897
Multitron Infors Not appplicable Bacterial incubator
PBS SLS P4417
Penicillin-Streptomycin SLS P0781
Petri dish Fisher Scientific 12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne Starlab CC7672-3340
Povidone iodine Weldricks pharmacy 2122828
Safe 2020 Fisher Scientific 1284804 Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15 Fisher Scientific O305
Scalpel Swann Morton Fisher Scientific 11849002

References

  1. Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
  2. Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
  3. Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
  4. Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
  5. Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
  6. Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
  7. Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
  8. Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
  9. Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
  10. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
  11. Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
  12. Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  13. Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
  14. Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  15. Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
  16. Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
  17. Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
  18. Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).

Play Video

Cite This Article
Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., Partridge, L., Garg, P., MacNeil, S., Monk, P. N., Karunakaran, E. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp. (159), e61156, doi:10.3791/61156 (2020).

View Video