Summary

Etablierung eines Porcine Ex Vivo Cornea Modells zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen gegen bakterielle Keratitis

Published: May 12, 2020
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Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Einrichtung eines Ex-vivo-Schweinemodells der bakteriellen Keratitis. Pseudomonas aeruginosa wird als prototypischer Organismus verwendet. Dieses innovative Modell imitiert in vivo-Infektionen, da die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Bakteriums abhängt, Hornhautgewebe zu schädigen.

Abstract

Bei der Entwicklung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe hängt der Erfolg von Tierversuchen von einer genauen Extrapolation der antimikrobiellen Wirksamkeit von In-vitro-Tests bis hin zu Tierinfektionen in vivo ab. Die bestehenden In-vitro-Tests überschätzen in der Regel die antimikrobielle Wirksamkeit, da das Vorhandensein von Wirtsgewebe als Diffusionsbarriere nicht berücksichtigt wird. Um diesen Engpass zu überwinden, haben wir ein ex vivo Porcine Corneal Modell der bakteriellen Keratitis unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa als prototypischem Organismus entwickelt. Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung der Schweinehornhaut und Protokoll für die Einrichtung der Infektion. Maßgeschneiderte Glasformen ermöglichen eine einfache Einrichtung der Hornhaut für Infektionsstudien. Das Modell imitiert in vivo-Infektion, da die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Bakteriums abhängt, Hornhautgewebe zu schädigen. Die Etablierung einer Infektion wird als eine Zunahme der Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten überprüft, die über lebensfähige Plattenzählungen bewertet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Infektion in den ex vivo Hornhäuten mit der hier beschriebenen Methode sehr reproduzierbar nachgewiesen werden kann. Das Modell kann in Zukunft erweitert werden, um Keratitis zu imitieren, die durch andere Mikroorganismen als P. aeruginosaverursacht wird. Das Endziel des Modells besteht darin, die Wirkung der antimikrobiellen Chemotherapie auf den Fortschritt einer bakteriellen Infektion in einem Szenario zu untersuchen, das repräsentativer für In-vivo-Infektionen ist. Auf diese Weise wird das hier beschriebene Modell den Einsatz von Tieren zu Testzwecken reduzieren, die Erfolgsraten in klinischen Studien verbessern und letztlich eine schnelle Übersetzung neuartiger antimikrobiellen Mittel in die Klinik ermöglichen.

Introduction

Hornhautinfektionen sind wichtige Ursachen für Erblindung und treten in epidemischen Ausmaßen in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen auf. Die Ätiologie der Krankheit variiert von Region zu Region, aber Bakterien machen die steile Mehrheit dieser Fälle aus. Pseudomonas aeruginosa ist ein wichtiger Erreger, der eine schnell fortschreitende Krankheit verursacht. In vielen Fällen, Patienten mit stromalen Narben, unregelmäßigen Astigmatismus links, erfordern Transplantation oder im schlimmsten Fall, verlieren ein Auge1,2.

Bakterielle Keratitis verursacht durch P. aeruginosa ist eine schwierige Augeninfektion zu behandeln, vor allem aufgrund der zunehmenden Entstehung von antimikrobiellen resistenten Stämmen von P. aeruginosa. Innerhalb des letzten Jahrzehnts hat sich gezeigt, dass das Testen und Entwickeln neuer Behandlungen für Hornhautinfektionen im Allgemeinen und solche, die durch Pseudomonas sp. verursacht werden, im Besonderen unerlässlich ist, um den aktuellen Trend der Antibiotikaresistenz zu bekämpfen3.

Für die Prüfung der Wirksamkeit neuer Behandlungen von Hornhautinfektionen sind konventionelle mikrobiologische In-vitro-Methoden aufgrund des Unterschieds in der bakteriellen Physiologie während der Laborkultur und bei Infektionen in vivo sowie aufgrund des Fehlens der Wirtsschnittstelle4,5ein schlechtes Ersatzzeichen. In-vivo-Tiermodelle sind jedoch teuer, zeitaufwändig, können nur eine kleine Anzahl von Repliken liefern und Bedenken hinsichtlich des Tierschutzes aufkommen lassen.

In diesem Artikel zeigen wir ein einfaches und reproduzierbares organotypisches Ex-vivo-Schweinemodell der Keratitis, das verwendet werden kann, um verschiedene Behandlungen auf akute und chronische Infektionen zu testen. Wir haben P. aeruginosa für dieses Experiment verwendet, aber das Modell funktioniert auch gut mit anderen Bakterien und Organismen wie Pilzen und Hefe, die Keratitis verursachen.

Protocol

Albino Laborkaninchen wurden im Labor für andere geplante experimentelle Arbeiten unter Home Office genehmigt Protokolle geopfert. Die Augen waren für den experimentellen Einsatz in diesen Studien nicht erforderlich, so dass sie für dieses Protokoll verwendet wurden. 1. Sterilisation KRITISCHER SCHRITT: Alle Zangen und Scheren durch Einweichen für 1 h in 5% (v/v) Lösung von Distel in destilliertem Wasser, mit einer Bürste reinigen, mit Leitungswasser abspülen und im Ofen bei 1…

Representative Results

Das Design der Glasformen ist eine innovative und originelle Idee, deren Verwendung es uns ermöglichte, das Modell in konsistenter Weise mit minimalen/keinen Problemen mit Verunreinigungen einzurichten. Die Formen wurden von einem Glasgebläse an der University of Sheffield auf der Grundlage eines Entwurfs(Abbildung 1A) hergestellt. Das Versuchsaufbau behält die konvexe Form der Hornhaut bei und hält Bakterien auf der Oberseite des Epithels, wo die Infektion stattfindet (<strong class="xf…

Discussion

Der Haupttreiber für die Entwicklung dieses Keratitismodells unter Verwendung von Ex-vivo-Schweinehornhaut besteht darin, Forschern, die neuartige antimikrobielle Mittel entwickeln, ein repräsentatives In-vitro-Modell zur genaueren Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit in den präklinischen Stadien zur Verfügung zu stellen. Dies wird Forschern, die an der Entwicklung neuer antimikrobiellen Mittel beteiligt sind, eine bessere Kontrolle über das Arzneimitteldesign und die Rezeptur in den präklinischen Stadien bi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Elliot Abattoir in Chesterfield für die Bereitstellung von Schweineaugen. Die Glasringe wurden nach unserem Design von dem Glasbläser Dan Jackson vom Department of Chemistry der University of Sheffield hergestellt. Die Autoren danken dem Medical Research Council (MR/S004688/1) für die Finanzierung. Die Autoren danken auch Frau Shanali Dikwella für die technische Hilfe bei der Hornhautzubereitung. Die Autoren danken Herrn Jonathan Emery für die Hilfe bei der Formatierung von Bildern.

Materials

50 mL Falcon tube SLS 352070
Amphotericin B Sigma A2942
Cellstar 12 well plate Greiner Bio-One 665180
Dextran Sigma 31425-100mg-F
Distel Fisher Scientific 12899357
DMEM + glutamax SLS D0819
Dual Oven Incubator SLS OVe1020 Sterilising oven
Epidermal growth factor SLS E5036-200UG
F12 HAM Sigma N4888
Foetal calf serum Labtech International CA-115/500
Forceps Fisher Scientific 15307805
Handheld homogeniser 220 Fisher Scientific 15575809 Homogeniser
Heracell VIOS 160i Thermo Scientific 15373212 Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R VWR 521-2242 Centrifuge
Insulin, recombinant Human SLS 91077C-1G
LB agar Sigma L2897
Multitron Infors Not appplicable Bacterial incubator
PBS SLS P4417
Penicillin-Streptomycin SLS P0781
Petri dish Fisher Scientific 12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne Starlab CC7672-3340
Povidone iodine Weldricks pharmacy 2122828
Safe 2020 Fisher Scientific 1284804 Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15 Fisher Scientific O305
Scalpel Swann Morton Fisher Scientific 11849002

References

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Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., Partridge, L., Garg, P., MacNeil, S., Monk, P. N., Karunakaran, E. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp. (159), e61156, doi:10.3791/61156 (2020).

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