Burada sunulan kolorektal HT29 hücrelerinden elde edilen kurulan kanser kök benzeri hücreleri koruyan aşırı ifade sürücü genleri keşfetmek için bir protokoldür. RNAseq mevcut biyoinformatik ile araştırılmış ve hedeflenen tümör hücrelerinin hayatta kalma dahil potansiyel bir mekanizma açıklığa kavuşturmak için gen ekspresyonu ağları ekran.
Kanser kök hücreleri klinik tedavilere karşı hayati bir rol oynar, tümör nüks katkıda. Tümörigenez ve kanser sapı özelliklerinin başlatılması nda birçok onkogen vardır. Kolorektal kanser kaynaklı tümör kürelerinin oluşumunda gen ekspresyonu belirsiz olduğundan, bir seferde bir gen üzerinde çalışan mekanizmaları keşfetmek zaman alır. Bu çalışma, kolorektal kanser kök benzeri hücrelerin in vitro hayatta kalma dahil sürücü genleri hızlı bir şekilde keşfetmek için bir yöntem göstermektedir. Kolorektal HT29 kanser hücreleri, küresel olarak kültürlendiğinde LGR5’i ifade eden ve bu çalışmada CD133 kök belirteçlerinin artmasına eşlik eden kanser hücreleri seçilmiş ve kullanılmıştır. Sunulan protokol, kolorektal HT29 kaynaklı kök benzeri tümör kürelerinin oluşumunda aşırı ifade edilen sürücü genlerini hızlı bir şekilde ortaya çıkarmak için mevcut biyoinformatik ile RNAseq’yi gerçekleştirmek için kullanılır. Metodoloji hızlı bir şekilde tarama ve diğer hastalık modellerinde potansiyel sürücü genleri keşfetmek.
Kolorektal kanser (CRC) yüksek yaygınlık ve mortalite dünya çapında 1 ile önde gelen ölüm nedenidir1,2. Gen mutasyonları ve amplifikasyonlar nedeniyle, kanser hücreleri proliferatif kontrol olmadan büyümek, hangi hücre sağkalım katkıda3, anti-apoptosis4, ve kanser sapı5,6,7. Tümör dokusu içinde tümör heterojenitesi tümör hücrelerinin terapötik tedaviler sırasında uyum sağlamasını ve hayatta kalmalarını sağlar8. Kanser kök hücreleri (CSCs), diferansiyel kanser türlerine göre kendini yenileme ve pluripotency daha yüksek bir oranda, esas olarak tümör nüks sorumludur9,10 ve metastatik CRC11. CSCs daha fazla ilaç direnci mevcut12,13,14 ve anti-apoptoz özellikleri15,16, böylece tümör kemoterapi hayatta.
Burada, seçilen CRC kök hücrelerinde köklük için potansiyel mekanizmayı araştırmak amacıyla, Tümör sferoidlerinde farklı olarak ifade edilen genleri taramak için RNAseq uygulandı. Kanser hücreleri, düşük yapışma koşullarında büyüdüğünde ve EGF, bFGF, HGF ve IL6 gibi kültürlü ortama eklenen büyüme faktörleri tarafından uyarıldığında küresel (tümör küreleri olarak da adlandırılır) oluşturabilir. Bu nedenle oksaliplatin ve irinoteon17ile tedavi edildiğinde fosforilasyonLU STAT3 artışı ile kemoterapiye direnen CRC HT29 tümör hücrelerini seçtik. Buna ek olarak, HT29 açıklanan kültür koşullarında kültürlü zaman yüksek kök belirteçleri ifade etti. HT29 türetilmiş CSC modeli lösin açısından zengin tekrar içeren G-protein-çiftreseptör 5 (LGR5)18,CRC kök hücrelerinin belirli bir belirteç19,,20yüksek miktarlarda ifade . Ayrıca, CD133, kanser kök hücreleri için genel bir biyomarker olarak kabul, ayrıca yüksek HT29 hücre hattı21ifade edilir. Bu protokolün amacı, bireysel onkogenlerin araştırılması yerine biyoinformatik veri setlerine dayalı kanser sapı benzeri tümör kürelerinde sürücü genlerinin gruplarını keşfetmektir22. Mevcut biyoinformatik analizleri takip eden RNAseq analizi ile potansiyel moleküler mekanizmaları inceler.
Yeni nesil sıralama, tümör tedavileri23rehberlik için kapsamlı ekran sürücü genleri için kullanılan hesaplamalı yardıma dayalı, yüksek iş gücü, kolayca kullanılabilir ve güvenilir DNA sıralama yöntemidir. Bu teknoloji aynı zamanda gen ekspresyonunu izole edilmiş bir RNA örneğinin ters transkripsiyonundan tespit etmek için de kullanılır24. Ancak RNAseq ile tarama yapılırken, tedavi ile hedeflenene en önemli genler deneysel ve kontrol örnekleri arasında en yüksek ekspresyon farkı olmayabilir. Bu nedenle, bazı biyoinformatik sınıflandırmak ve KEGG25, GO26,27, veya PANTHER28gibi mevcut veri setleri dayalı genlerin sınıflandırılması ve tanımlanması için geliştirilmiştir , Marifet Pathway Analizi dahil (IPA)29 ve NetworkAnalyst30. Bu protokol, seçilen HT29 türetilmiş küresel hücrelerdeki bir grup geni ebeveyn HT29 hücrelerine kıyasla hızlı bir şekilde keşfetmek için RNAseq ve NetworkAnalyst’in entegrasyonunu göstermektedir. Bu yöntemin diğer hastalık modellerine uygulanması da önemli genlerdeki farklılıkların keşfedilmesi için önerilmektedir.
Bireysel gen ekspresyonunun araştırılmasıile karşılaştırıldığında, yüksek iş gücü tekniği tümör hassas tıbbı için potansiyel sürücü genlerini kolayca bulma nın avantajlarını sağlar. KEGG, GO veya PANTHER gibi yararlı veri kümeleri ile, belirli genler hastalık modelleri, sinyal yolları veya belirli fonksiyonlara göre tanımlanabilir ve bu hızlı bir şekilde belirli, önemli genlere odaklanmanızı, zaman ve araştırma maliyetlerinden tasarruf etmenizi sağlar. Benzer bir uygulama önceki çalışmalarda14,18,31kullanılır. Özellikle, tümörlerin farklı türleri hayatta kalma ve çoğalma için ayırt edici genler ve yollar ifade çünkü bir tümör daha karmaşıktır. Bu nedenle, bu protokol farklı koşullar altında farklı tümör tiplerini ayıran genleri toplayabilir. Spesifik gen ekspresyonunun mekanizmasını anlayarak kanserlere karşı etkili stratejiler bulma potansiyeli vardır.
Bu çalışmada, mevcut biyoinformatik ile RNAseq verilerinin analizinde kültürkanser sapbenzeri tümörküreler model olarak kullanılmıştır. Bir hastalık modeli için HT29 türetilmiş tümör küreler kullanıldı. Tümör küreleri tümör tedavilerine karşı ilaç direncine sahip olduğundan, gen ekspresyonundaki farklılıkları araştırarak direnç lerinin ayrıntılı mekanizmalarını araştırmak için kurulan model kullanılabilir. Ayrıca, mevcut biyoinformatik ile RNAseq kullanarak genomik teknoloji …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Radyasyon Biyoloji çekirdek laboratuvarı Radyolojik Araştırma Enstitüsü, Chang Gung Memorial Hastanesi, teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Chang Gung Memorial Hastanesi (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) ve Mackay Memorial Hastanesi (MMH-CT-10605 ve MMH-106-61) tarafından desteklenmiştir. Finansman kuruluşlarının çalışmanın ve verilerin toplanması, analiz ve yorumlanmasında veya makalenin yazımında herhangi bir etkisi yoktu.
iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |