대장 HT29 유래 암 줄기 와 같은 종양스피어에서 드라이버 유전자의 발견
Summary
여기에 제시된 대장 HT29 세포로부터 유래된 확립된 암 줄기 유사 세포를 유지하는 과발현 드라이버 유전자를 발견하는 프로토콜이다. 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq는 표적 종양 세포의 생존에 관여하는 잠재적인 기계장치를 해명하기 위한 유전자 발현 네트워크를 조사하고 스크린하기 위하여 수행되었다.
Abstract
암 줄기 세포는 종양 재발에 기여하는 임상 치료에 대하여 중요한 역할을 합니다. 종양 발생 및 암 줄기 특성의 개시에 관여하는 많은 종양 유전자가 있습니다. 대장암 유래 종양구의 형성에 있는 유전자 발현은 불분명하기 때문에, 한 번에 한 유전자에 작동하는 기계장치를 발견하는 데 시간이 걸립니다. 이 연구는 체외에서 대장암 줄기와 같은 세포의 생존에 관여하는 운전자 유전자를 신속하게 발견하는 방법을 보여줍니다. 구체형으로 배양되고 CD133 줄기마커를 동반하여 LGR5를 발현하는 대장 HT29 암세포가 이 연구에서 선택되고 사용되었다. 제시된 프로토콜은 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq를 능력을 발휘하기 위하여 이용가능한 HT29 유래 줄기 같이 종양스피어의 대형에 있는 과발현된 드라이버 유전자를 빨리 밝히기 위하여 이용됩니다. 방법론은 다른 질병 모델에서 잠재적인 운전자 유전자를 신속하게 선별하고 발견할 수 있습니다.
Introduction
대장암(CRC)은 전 세계적으로 높은 유병률과 사망률을 가진 주요 사망 원인1,,2이다. 유전자 돌연변이 및 증폭으로 인해 암세포는 세포 생존 3, 항 세포멸4,4암 줄기5,,6,67에기여하는 증식 제어 없이 성장한다. 종양 조직 내에서 종양 이질성은 종양 세포가 치료 치료 중에 적응하고 생존할 수 있게 합니다8. 암 줄기세포(CSC)는 차동암 유형보다 자가재생 및 자발성율이 높은 것으로, 종양 재발9,10 및전이성 CRC11에주로 책임이 있다. CSC는 더 많은 약물내성(12,,13,,14 및 항세포증 속성15,16)을16제시하여 종양 화학요법을 생존시킨다.
여기서, 선택된 CRC 줄기 세포에서 줄기에 대한 잠재적기심을 조사하기 위해, RNAAeq는 종양 스페로이드에서 분화유전자를 선별하기 위해 수행되었다. 암세포는 낮은 준수 조건에서 성장하고 EGF, bFGF, HGF 및 IL6를 포함하여 배양 된 매체에 추가 된 성장 인자에 의해 자극 될 때 스페로이드 (또한 종양스피어라고도 함)를 형성 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 oxaliplatin 및 irinotecon17로취급될 때 인지질 STAT3의 증가와 화학요법저항하는 CRC HT29 종양 세포를 선택했습니다. 또한, HT29는 기재된 배양 조건에서 배양할 때 더 높은 줄기 마커를 표현하였다. HT29 유래 CSC 모델은 더 많은 양의 류신-리치 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 5(LGR5)18,CRC 줄기 세포의 특이적마커(19,,20)를발현하였다. 더욱이, CD133은암줄기세포를 위한 일반적인 바이오마커로 여겨지며, 또한 HT29세포주(21)에서도높게 발현된다. 이 프로토콜의 목적은 생물정보학 데이터 집합에 기초한 확립된 암 줄기 같이 종양권에 있는 드라이버 유전자의 단을 개별 종양발생(22)을조사하는 것과 는 반대로 발견하는 것입니다. 그것은 가능한 생물 정보학 분석 뒤에 RNAseq 분석을 통해 잠재적인 분자 기계장치를 조사합니다.
차세대 시퀀싱은 종양 치료 유도를 위한 드라이버 유전자를 포괄적으로 검사하는 데 사용되는 계산 적 도움을 기반으로 높은 처리량, 용이성 및 신뢰할 수있는 DNA 시퀀싱방법입니다(23). 이 기술은 또한 고립된 RNA샘플(24)의역전사로부터 유전자 발현을 검출하는 데 사용된다. 그러나, RNAseq로 검열할 때, 치료로 표적으로 하는 가장 중요한 유전자는 실험과 대조견본 사이 가장 높은 발현 차액이 없을 지도 모릅니다. 따라서, 일부 생물정보학은 KEGG 25, GO26,27,또는,표범(28)과같은 현재 데이터 집합을 기반으로 유전자를 분류하고 식별하기 위해 개발되었으며, 인네티웨이 분석(IPA)(IPA) (29) 및 NetworkAnalyst30을포함한다.25 이 프로토콜은 RNAseq및 NetworkAnalyst의 통합을 보여주며 부모 HT29 세포에 비해 선택된 HT29 유래 스페로이드에서 유전자 그룹을 신속하게 발견합니다. 다른 질병 모델에 이 방법의 응용 은 또한 중요한 유전자에 있는 다름을 발견하기 위한 건의됩니다.
개별 유전자 발현의 조사에 비해, 고처리량 기술은 종양 정밀 의학을 위한 잠재적인 드라이버 유전자를 쉽게 찾아내고 있는 이점을 제공합니다. KEGG, GO 또는 PantHER와 같은 유용한 데이터 세트를 사용하면 질병 모델, 신호 경로 또는 특정 기능에 따라 특정 유전자를 식별할 수 있으며, 이를 통해 구체적이고 중요한 유전자에 빠르게 초점을 맞추고 시간과 연구 비용을 절약할 수 있습니다. 이전 연구에서도 유사한 적용이 사용된다14,,18,,31. 특히, 종양의 다른 모형은 생존과 증식을 위한 구별되는 유전자 그리고 통로를 표현하기 때문에 종양은 더 복잡합니다. 따라서, 이 프로토콜은 상이한 상황에서 다른 종양 유형을 구별하는 유전자를 선택할 수 있다. 특정 유전자 발현의 메커니즘을 이해하여 암에 대한 효과적인 전략을 찾을 수있는 잠재력이 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는, 배양된 암 줄기 같이 종양스피어는 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq 데이터를 분석하는 모형으로 이용되었습니다. 질병 모델의 경우 HT29 유래 종양스피어가 사용되었습니다. 종양권은 종양 치료에 대한 약물 내성을 가지고 있기 때문에, 확립 된 모델은 유전자 발현의 차이를 조사하여 저항의 상세한 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 사용 가능한 생물정보?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 방사선 연구 연구소의 방사선 생물학 핵심 연구소, 장궁 기념 병원, 기술 지원을 감사드립니다. 이 연구는 장궁 기념 병원 (CMRPD1J0321), 청 신 종합 병원 (CHGH 106-06), 맥케이 메모리얼 병원 (MMH-CT-10605 및 MMH-106-61)의 보조금에 의해 지원되었다. 자금 조달 기관은 연구 및 데이터 수집, 분석 및 해석 또는 원고 작성에 영향을 미치지 않았습니다.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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