هنا هو بروتوكول لاكتشاف جينات السائق المفرطة في التعبير عن الحفاظ على الخلايا الجذعية السرطان المنشأة المستمدة من خلايا HT29 القولون والمستقيم. تم تنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للتحقيق وفحص شبكات التعبير الجيني لتوضيح آلية محتملة تشارك في بقاء الخلايا السرطانية المستهدفة.
تلعب الخلايا الجذعية السرطانية دورًا حيويًا ضد العلاجات السريرية، مما يساهم في انتكاس الورم. هناك العديد من الأونكوجينات المشاركة في ورمريجنيسيس وبدء خصائص الجذعية السرطان. وبما أن التعبير الجيني في تكوين أورام الخلايا القولونية المشتقة من سرطان القولون والمستقيم غير واضح، فإن اكتشاف الآليات التي تعمل على جين واحد في كل مرة يستغرق وقتاً. توضح هذه الدراسة طريقة لاكتشاف جينات السائق المشاركة في بقاء الخلايا الجذعية الشبيهة بسرطان القولون والمستقيم في المختبر. تم اختيار الخلايا السرطانية HT29 القولون والمستقيم التي تعبر عن LGR5 عندما مثقف كما spheroids ومرافقة زيادة علامات الجذعية CD133 واستخدامها في هذه الدراسة. يتم استخدام البروتوكول المقدم لتنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للكشف بسرعة عن جينات السائق المفرط في تشكيل HT29 مستقيم مشتقة من الأورام الجذعية مثل. ويمكن للمنهجية أن تفحص تكتشف بسرعة جينات السائق المحتمل في نماذج أمراض أخرى.
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي للوفاة مع ارتفاع معدل انتشار ووفيات في جميع أنحاء العالم1,2. بسبب الطفرات الجينية والتضخيم، تنمو الخلايا السرطانية دون السيطرة التكاثرية، مما يساهم في بقاء الخلايا3، المضادة لتخثر الدم4، والسرطان stemness5،6،7. داخل نسيج الورم، يسمح عدم تجانس الورم للخلايا السرطانية بالتكيف والبقاء على قيد الحياة أثناء العلاجات العلاجية8. الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs), مع معدل أعلى من التجديد الذاتي و تعدد القدرات من أنواع السرطان التفاضلية, هي المسؤولة بشكل رئيسي عن تكرار الورم9,,10 و CRC11النقيلي . CSCs الحاضر أكثر مقاومة للأدوية12,13,,14 و خصائص مضادة لتخثر الدم15,16, وبالتالي نجاة الأورام العلاج الكيميائي.
هنا، من أجل التحقيق في الآلية المحتملة ل stemness في الخلايا الجذعية CRC مختارة، تم تنفيذ RNAseq لفحص الجينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي في spheroids الورم. الخلايا السرطانية يمكن أن تشكل spheroids (وتسمى أيضا أورامسفيرس) عندما تنمو في ظروف الالتزام المنخفضة وحفزت عوامل النمو المضافة إلى المتوسطة مثقف, بما في ذلك EGF, bFGF, HGF, وIL6. ولذلك، اخترنا CRC HT29 الخلايا السرطانية التي تقاوم العلاج الكيميائي مع زيادة في STAT3 الفوسفورية عندما تعامل مع oxaliplatin وirinotecon17. بالإضافة إلى ذلك، أعرب HT29 علامات الصلابة أعلى عندما مثقف في ظروف الثقافة الموصوفة. أعرب نموذج CSC المستمدة من HT29 كميات أعلى من تكرار الغنية بالليسين التي تحتوي على مستقبلات G-protein-coupled 5 (LGR5)18, علامة محددة من الخلايا الجذعية CRC19,20. وعلاوة على ذلك، CD133، تعتبر علامة حيوية عامة للخلايا الجذعية السرطانية، وأعرب أيضا عن ذلك بشدة في خط الخلية HT2921. الغرض من هذا البروتوكول هو اكتشاف مجموعات من جينات السائق في الأورام السرطانية المنشأة الشبيهة بـ stem استناداً إلى مجموعات البيانات المعلوماتية الحيوية بدلاً من التحقيق في أونكوجينيس الفردية22. وهو يحقق في الآليات الجزيئية المحتملة من خلال تحليل RNAseq متبوعاً بتحليلات المعلوماتية الحيوية المتاحة.
الجيل التالي هو عالية الإنتاجية ، متاحة بسهولة ، وموثوق بها الحمض النووي طريقة التسلسل على أساس المساعدة الحسابية ، وتستخدم لفرز شامل الجينات السائق لتوجيه علاجات الورم23. وتستخدم أيضا التكنولوجيا للكشف عن التعبير الجيني من النسخ العكسي لعينة معزولة RNA24. ومع ذلك، عند الفحص مع RNAseq، قد لا يكون للجينات الأكثر أهمية لاستهداف مع العلاج أعلى الفرق التعبير بين العينات التجريبية والسيطرة. لذلك ، تم تطوير بعض المعلوماتية الحيوية لتصنيف وتحديد الجينات على أساس مجموعات البيانات الحالية مثل KEGG25، GO26،27، أو PANTHER28، بما في ذلك تحليل مسار الإبداع (IPA)29 و NetworkAnalyst30. هذا البروتوكول يظهر التكامل بين RNAseq و NetworkAnalyst لاكتشاف مجموعة من الجينات بسرعة في spheroids HT29 المشتقة من HT29 مقارنة مع خلايا HT29 الأبوية. كما يقترح تطبيق هذه الطريقة على نماذج الأمراض الأخرى لاكتشاف الاختلافات في الجينات الهامة.
بالمقارنة مع التحقيق في التعبير الجيني الفردي ، فإن تقنية عالية الإنتاجية توفر مزايا للعثور على جينات السائق المحتملة بسهولة للطب الدقيق للورم. مع مجموعات البيانات المفيدة مثل KEGG أو GO أو PANTHER ، يمكن تحديد جينات محددة استنادًا إلى نماذج المرض ، أو مسارات الإشارة ، أو وظائف محددة ، وهذا يسمح بالتركيز بسرعة على جينات محددة ومهمة ، مما يوفر الوقت وتكاليف البحث. ويستخدم تطبيق مماثل في الدراسات السابقة14،18،31. على وجه الخصوص، الورم هو أكثر تعقيدا لأن أنواع مختلفة من الأورام تعبر عن الجينات التمييزية ومسارات البقاء على قيد الحياة والانتشار. لذلك، يمكن لهذا البروتوكول التقاط الجينات التي تميز أنواع الأورام المختلفة في ظل ظروف مختلفة. هناك إمكانية لإيجاد استراتيجيات فعالة لمكافحة السرطان من خلال فهم آلية التعبير الجيني المحدد.
في هذه الدراسة، تم استخدام أورام مثل السرطان مثل السرطان المستزرع كنموذج في تحليل بيانات RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة. لنموذج المرض، تم استخدام أورام مشتقة من HT29. لأن الأورام لديها مقاومة للأدوية ضد علاجات الورم، يمكن استخدام النموذج المنشأة للتحقيق في الآليات التفصيلية للمقاومة ?…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون المختبر الأساسي لمختبرات البيولوجيا الإشعاعية التابع لمعهد البحوث الإشعاعية، مستشفى تشانغ جونج التذكاري، على الدعم التقني. وقد دعمت هذه الدراسة من المنح من مستشفى تشانغ جونج التذكاري (CMRPD1J0321), مستشفى تشنغ هسين العام (هرمون النمو 106-06), ومستشفى ماكاي التذكاري (MMH-CT-10605 وMMH-106-61). ولم يكن لهيئات التمويل أي تأثير في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها وتفسيرها أو في كتابة المخطوطة.
iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |