Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para descobrir os genes condutores superexpressos mantendo as células-tronco de câncer estabelecidas derivadas de células HT29 colorretais. RNAseq com bioinformática disponível foi realizado para investigar e tela redes de expressão genética para elucidar um mecanismo potencial envolvido na sobrevivência de células tumorais direcionadas.
Abstract
As células-tronco cancerígenas desempenham um papel vital contra as terapias clínicas, contribuindo para a recaída do tumor. Há muitos oncogenes envolvidos na tumorigênese e no início das propriedades de câncer. Como a expressão genética na formação de tumores derivados do câncer colorretal não é clara, leva tempo para descobrir os mecanismos que trabalham em um gene de cada vez. Este estudo demonstra um método para descobrir rapidamente os genes condutores envolvidos na sobrevivência das células-tronco do câncer colorretal in vitro. Foram selecionadas e utilizadas neste estudo as células cancerígenas Colorretal HT29 que expressam o LGR5 quando cultivadas como esferoides e acompanham um aumento dos marcadores de caule CD133. O protocolo apresentado é usado para realizar o RNAseq com bioinformática disponível para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos na formação de tumores derivados de haste HT29 colorretais. A metodologia pode rapidamente rastrear e descobrir potenciais genes driver em outros modelos de doenças.
Introduction
O câncer colorretal (C CRC) é uma das principais causas de morte com alta prevalência e mortalidade em todo o mundo1,2. Devido a mutações genéticas e amplificações, as células cancerígenas crescem sem controle proliferativo, o que contribui para a sobrevivência celular3, anti-apoptose4e câncer5,,6,7. Dentro de um tecido tumoral, a heterogeneidade tumoral permite que as células tumorais se adaptem e sobrevivam durante os tratamentos terapêuticos8. As células-tronco cancerígenas (CSCs), com maior taxa de autoconexão e pluripotência do que os tipos diferenciais de câncer, são as principais responsáveis pela recidiva do tumor9,,10 e CRC metastática11. Os CSCs apresentam mais resistência a medicamentos12,,13,14 e propriedades anti-apoptose15,16, sobrevivendo assim às quimioterapias tumorais.
Aqui, a fim de investigar o mecanismo potencial de stemness nas células-tronco CRC selecionadas, rnAseq foi realizado para tela de genes expressos diferencialmente em esferoides tumorais. As células cancerígenas podem formar esferoides (também chamados de tumores) quando cultivadas em condições de baixa adesão e estimuladas por fatores de crescimento adicionados ao meio cultivado, incluindo EGF, bFGF, HGF e IL6. Por isso, selecionamos células tumorais CRC HT29 que resistem às quimioterapias com aumento do STAT3 fosforilado quando tratadas com oxaliplatina e irinotecon17. Além disso, o HT29 expressou marcadores de maior caule quando cultivado nas condições de cultura descritas. O modelo CSC derivado do HT29 expressou maiores quantidades de receptor g-proteína-acoplado à proteína G 5 (LGR5)18, um marcador específico das células-tronco CRC19,,20. Além disso, o CD133, considerado um biomarcador geral para células-tronco cancerosas, também é altamente expresso na linha21 celular HT29. O objetivo deste protocolo é descobrir grupos de genes condutores nos tumores semelhantes a câncer estabelecidos com base em conjuntos de dados bioinformáticas em vez de investigar oncogenes individuais22. Investiga potenciais mecanismos moleculares através da análise RNAseq seguida de análises bioinformática disponíveis.
O sequenciamento da próxima geração é um método de sequenciamento de DNA de alta produtividade, facilmente disponível e confiável baseado na ajuda computacional, usado para rastrear abrangentemente genes do driver para orientar as terapias tumorais23. A tecnologia também é usada para detectar expressão genética a partir da transcrição reversa de uma amostra isolada de RNA24. No entanto, ao fazer a triagem com RNAseq, os genes mais importantes para atingir a terapia podem não ter o maior diferencial de expressão entre amostras experimentais e de controle. Assim, algumas bioinformáticas foram desenvolvidas para classificar e identificar genes com base em conjuntos de dados atuais como KEGG25, GO26,27ou PANTHER28, incluindo Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 e NetworkAnalyst30. Este protocolo mostra a integração do RNAseq e do NetworkAnalyst para descobrir rapidamente um grupo de genes nos esferoides derivados de HT29 selecionados em comparação com as células HT29 parentais. A aplicação desse método a outros modelos de doenças também é sugerida para descobrir diferenças em genes importantes.
Em comparação com a investigação da expressão genética individual, uma técnica de alto rendimento fornece vantagens para encontrar genes potenciais driver facilmente para a medicina de precisão tumoral. Com conjuntos de dados úteis como KEGG, GO ou PANTHER, genes específicos podem ser identificados com base nos modelos de doença, caminhos de sinalização ou funções específicas, e isso permite focar rapidamente em genes específicos e importantes, economizando tempo e custos de pesquisa. Uma aplicação semelhante é usada em estudos anteriores14,,18,31. Particularmente, um tumor é mais complicado porque diferentes tipos de tumores expressam genes e caminhos distintos para sobrevivência e proliferação. Portanto, este protocolo pode captar genes que distinguem diferentes tipos de tumores em diferentes circunstâncias. Há o potencial de encontrar estratégias eficazes contra os cânceres, entendendo o mecanismo de expressão genética específica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, tumores semelhantes a câncer cultivados foram utilizados como modelo na análise dos dados rnAseq com bioinformática disponível. Para um modelo de doença, foram utilizadas tumores derivados de HT29. Como os tumores têm resistência a medicamentos contra terapias tumorais, o modelo estabelecido pode ser usado para investigar os mecanismos detalhados de resistência, investigando diferenças na expressão genética. Além disso, a tecnologia genômica usando rnAseq com bioinformática disponível fornece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Laboratório Central de Biologia da Radiação do Instituto de Pesquisa Radiológica, Chang Gung Memorial Hospital, pelo apoio técnico. Este estudo foi apoiado por subsídios do Hospital Memorial Chang Gung (CMRPD1J0321), Do Hospital Geral cheng Hsin (CHGH 106-06) e do Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Os órgãos financiadores não influenciaram na concepção do estudo e coleta de dados, análise e interpretação dos dados ou na redação do manuscrito.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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