Katı tümör hücre hatlarındaki yan popülasyon hücrelerinin oranını ölçmek için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunulmuştur.
Kanser kök hücreleri (KSS) tümör büyümesi, metastaz ve nüksün önemli bir nedenidir. CSC’lerin izolasyonu ve tanımlanması tümör araştırmaları için büyük önem taşımaktadır. Günümüzde CSC’lerin tümör dokularından ve tümör hücre hatlarından tanımlanması ve saflaştırılması için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Yan popülasyon (SP) hücrelerinin ayrılması ve analizi yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir. Yöntemler, CSC’lerin Hoechst 33342 gibi floresan boyaları hızla dışarı atma yeteneğine dayanır. Boyanın efflux’u ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ile ilişkilidir ve ABC taşıyıcı inhibitörleri tarafından engellenebilir. Hoechst 33342 ile kültürlü tümör hücrelerini boyama ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile oranını analiz etme yöntemleri açıklanmıştır. Bu test kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu testte oluşturulan veriler, genlerin veya diğer hücre dışı ve hücre içi sinyallerin tümör hücrelerinin köklük özellikleri üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Kanser kök hücreleri (CSC’ ler), tümör büyümesi, metastaz ve nüks1,2’dehayati rol oynayan, kendini yenileme yeteneğine ve çoklu farklılaşma potansiyeline sahip hücrelerin alt kümeleridir. Şu anda, CSC’lerin akciğer, beyin, pankreas, prostat, meme ve karaciğer kanserleri 3, 4 , 5 ,6,7,8,9dahil olmak üzere çeşitli kötü huylu tümörlerde varolduğutanımlanmıştır. Bu tümörlerde CSC’lerin tanımlanması esas olarak CD44, CD24, CD133 ve Sca-19,10 ‘un yüksek ve/veya düşük ekspresyosu gibi yüzey belirteç proteinlerinin varlığına dayanmaktadır, ancak CSC’leri CSC olmayanlardan ayırt edebilecek benzersiz bir belirteç şimdiye kadar bildirilmemiştir. Şu anda tümör dokusunda veya tümör hücre hatlarında CSC’leri tanımlamak ve arındırmak için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Bu teknikler CSC’lerin belirli özelliklerine göre tasarlanmıştır. Bunlar arasında, yan popülasyon (SP) hücrelerinin tahlilleri ve sıraları yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir.
SP hücreleri başlangıçta Goodell ve ark.11, fare kemik iliği hücrelerinde hematopoetik kök hücreleri karakterize ettiklerinde keşfedildi. Fare kemik iliği hücreleri floresan boya Hoechst 33342 ile etiketlendiğinde, bir akış sitometrisi testinin iki boyutlu nokta grafiğinde hoechst 33342 loş lekeli hücrelerin küçük bir grubu ortaya çıktı. Hoechst 33342 DNA bağlayıcı bir boyadır ve farklı spektral özelliklere yol açan en az iki bağlama moduna sahiptir. Floresan emisyonu aynı anda iki dalga boyunda görüntülerken, birden fazla popülasyon ortaya çıkabilir12. Tahlillerinde Hoechst 33342 350 nm’de heyecanlandı ve floresan 450/20 nm bant geçişi (BP) filtresi ve 675 nm kenar filtresi uzun geçiş (EFLP)11kullanılarak ölçüldü. Kemik iliği hücrelerinin tüm popülasyonu ile karşılaştırıldığında, bu hücre grubu SP hücreleri11adı verilen hematopoetik kök hücreler ile zenginleştirilmiştir. SP hücreleri Hoechst 33342’yi hızla dışarı atabilir. Bu boyanın efflux ile ilgilidir ATP bağlayıcı kaset (ABC) transporters13Fumitremorgin C14, Verapamil ve Reserpine 15,16gibi bazı ajanlar tarafından inhibe edilebilir. Bundan sonra, çeşitli dokularda, organlarda, tümör dokularında ve tümör hücre hatlarında farklı oranlarda SP hücreleri tespit edildi17,18,19. Bu SP hücreleri kök hücrelerin birçok özelliğine sahiptir17,19.
Bu makalede Hoechst 33342 kültürlü tümör hücrelerinin etiketlenerek boyanması ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile analizi açıklanmaktadır. Ayrıca Hoechst 33342 konsantrasyonunun optimizasyonu ve bu yaklaşım kullanılarak belirli bir tümör hücre hattı için uygun bloker seçimi gösterilmiştir. Son olarak, saplanma terfisi veya inhibisyon sinyallerinin tümör hücrelerindeki SP oranı üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Deneysel örnekler, SP’nin analizinin gen ekspresyatörleri, küçük inhibitörler, aktivatörler, sitokinler ve kemokinler gibi çeşitli sinyallerin tümör saplığı üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir. CD44+/CD24– popülasyonun sıralenmesi, aldehit dehidrogenaz (ALDH) analizi ve tümör küre oluşumu tahlilleri gibi CSC’lerin izolasyonu ve saflaştırılması için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem manipülasyon için daha kolaydır ve uygun maliyetlidir.
SP tahlilleri için akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardır. Birincisi, her hücre hattı için Verapamil veya Reserpine gibi uygun bir engelleyicinin seçilmesidir, çünkü SP hücrelerinin “kapı” konumu, engelleyicinin eklenmesinden sonra çok sayıda SP hücresinin kaybolduğu konuma göre belirlenir. MDA-MB-231 hücre hattı için Reserpine iyi çalışır. Ancak, diğer hücre hatları için farklı engelleyiciler daha iyi çalışabilir.
İkincisi Hoechst 33342 konsant…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Çin doğa bilimleri vakfı tarafından finanse edildi 81572599, 81773124 ve 81972787; Tianjin Şehri Doğa Bilimleri Vakfı (Çin) 19JCYBJC27300; Tianjin Halk Hastanesi & Nankai Üniversitesi İşbirlikçi Araştırma Hibesi 2016rmnk005; Nankai Üniversitesi Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları 63191153.
6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |