מוצגת שיטה נוחה, מהירה וחסכונית למדידת חלקם של תאי אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מוצקים.
תאי גזע סרטניים (CSCs) הם גורם חשוב לצמיחה הגידול, גרורות, הישנות. בידוד וזיהוי של CSCs הם בעלי משמעות רבה למחקר הגידול. כיום, מספר טכניקות משמשות לזיהוי וטיהור של CSCs מרקמות הגידול וקווי תאים סרטניים. הפרדה וניתוח של תאי אוכלוסיית צד (SP) הם שתיים מהשיטות הנפוצות. השיטות מסתמכות על היכולת של CSCs לגרש במהירות צבעים פלואורסצנטיים, כגון Hoechst 33342. הקולח של הצבע מזוהה עם משגרים ATP מחייב (ABC) והוא יכול להיות מעוכב על ידי מעכבי טרנספורטר ABC. שיטות להכתמת תאים סרטניים בתרבית עם Hoechst 33342 וניתוח חלקם של תאי SP שלהם על ידי cytometry זרימה מתוארים. הבדיקה הזו נוחה, מהירה וחסכונית. נתונים הנוצרים במהלך מבחנים אלה יכולים לתרום להבנה טובה יותר של השפעתם של גנים או אותות חוץ-תאיים ותאיים אחרים על תכונות הגבעול של תאים סרטניים.
תאי גזע סרטניים (CSCs) הם תת-קבוצות של תאים עם יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל בידול מרובה, אשר ממלאים תפקיד חיוני בצמיחת הגידול, גרורות והישנות1,2. נכון לעכשיו, CSCs זוהו להתקיים במגוון רחב של גידולים ממאירים, כולל ריאות, מוח, לבלב, הערמונית, השד, וסרטן הכבד3,4,5,6,7,8,9. זיהוי של CSCs בגידולים אלה מבוסס בעיקר על נוכחות של חלבוני סמן פני השטח, כגון ביטוי גבוה ו / או נמוך של CD44, CD24, CD133, ו Sca-19,10, אבל סמן ייחודי שיכול להבחין בין CSCs שאינם CSCs לא דווח עד כה. כיום, מספר טכניקות משמשות כדי לזהות ולטהר CSCs ברקמת הגידול או קווי תאים סרטניים. טכניקות אלה מתוכננות בהתבסס על המאפיינים הספציפיים של CSCs. ביניהם, מבחנים ומיון של תאי אוכלוסיית צד (SP) הם שתיים מהשיטות הנפוצות.
תאי SP התגלו במקור על ידי גודל ואח’11, כאשר הם אפיינו תאי גזע hematopoietic בתאי מח עצם העכבר. כאשר תאי מח העצם של העכבר סומנו עם צבע פלואורסצנטי Hoechst 33342, קבוצה קטנה של תאים מוכתמים באפלולית Hoechst 33342 הופיעו בעלילת נקודה דו מימדית של מבחני ציטומטריה זרימה. Hoechst 33342 הוא צבע מחייב DNA ויש לו לפחות שני מצבי קשירה שמובילים למאפיינים ספקטרליים שונים. בעת צפייה פליטת פלואורסצנטיות בשני אורכי גל בו זמנית, אוכלוסיות מרובות ניתן לחשוף12. במהלך ההסתערות שלהם, Hoechst 33342 היה נרגש ב 350 ננומטר ואת הפלואורסצנטי נמדד באמצעות מסנן פס 450/20 ננומטר (BP) ו 675 ננומטר קצה מסנן ארוך לעבור (EFLP)11. בהשוואה לאוכלוסייה שלמה של תאי מח עצם, קבוצה זו של תאים הועשרה בתאי גזע hematopoietic בשם תאי SP11. תאי SP מסוגלים לגרש במהירות את Hoechst 33342. הקולח של צבע זה קשור לקלטת מחייבת ATP (ABC) טרנספורטרים13, אשר יכול להיות מעוכב על ידי סוכנים מסוימים כגון Fumitremorgin C14, Verapamil ו Reserpine15,16. לאחר מכן, פרופורציות שונות של תאי SP זוהו במגוון רקמות, איברים, רקמות גידול, וקווי תאים סרטניים17,18,19. לתאי SP אלה מאפיינים רבים של תאי גזע17,19.
כתב יד זה מתאר Hoechst 33342 תיוג וכתמים של תאים סרטניים מתורבתים וניתוח של תאי SP על ידי cytometry זרימה. יתר על כן, אופטימיזציה של ריכוז Hoechst 33342 ואת הבחירה חוסם הנכון עבור קו תא גידול ספציפי באמצעות גישה זו מוצגים. לבסוף, ההשפעות של קידום stemness או אותות עיכוב על חלקם של SP בתאי הגידול מודגמים. הדוגמאות הניסיוניות מראות שניתוח של SP יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של אותות שונים, כגון ביטוי גנים, מעכבים קטנים, מפעילים, ציטוקינים וכימוקינים, על גזע הגידול. בהשוואה לשיטות אחרות לבידוד וטיהור של CSCs, כגון מיון של CD44+/CD24– אוכלוסייה, ניתוח אלדהיד דהידרוגנאז (ALDH) ומבחני היווצרות כדור הגידול, שיטה זו קלה יותר למניפולציה והיא חסכונית.
קיימות מספר נקודות מפתח שיש לזכור עבור ה- SP assay. הראשון הוא הבחירה של חוסם מתאים, כגון Verapamil או Reserpine, עבור כל קו תא, מכיוון שמיקום “השער” של תאי SP נקבע בהתאם למיקום שבו מספר גדול של תאי SP נעלמים לאחר הוספת החוסם. עבור קו התא MDA-MB-231, Reserpine עובד היטב. עם זאת, עבור קווי תאים אחרים, חוסמים שונים עשויים ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין 81572599, 81773124 81972787; הקרן למדעי הטבע של העיר טיינג’ין (סין) 19JCYBJC27300; בית החולים העממי טיינג’ין & Nankai אוניברסיטת מחקר משותף מענק 2016rmnk005; קרנות מחקר בסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות, אוניברסיטת ננקאי 63191153.
6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |