Un método conveniente, rápido, y rentable de medir la proporción de células de población laterales en variedades de células sólidas del tumor se presenta.
Las células madre cancerosas (CSCs) son una causa importante del crecimiento del tumor, de la metástasis, y de la repetición. El aislamiento y la identificación de CSCs son de gran importancia para la investigación del tumor. Actualmente, varias técnicas se utilizan para la identificación y purificación de CSCs de tejidos del tumor y de variedades de células del tumor. La separación y el análisis de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos de uso general. Los métodos se basan en la capacidad de los CSCs para expulsar rápidamente los tintes fluorescentes, como Hoechst 33342. La emanación del tinte se asocia con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC) y puede ser inhibida por inhibidores del transportador ABC. Los métodos para la coloración de las células cultivadas del tumor con Hoechst 33342 y para analizar la proporción de sus células del SP por cytometry de flujo se describen. Este ensayo es conveniente, rápido y rentable. Los datos generados en este ensayo pueden contribuir a una mejor comprensión del efecto de los genes u otras señales extracelulares e intracelulares sobre las propiedades de stemness de las células tumorales.
Las células madre cancerosas (CSCs) son subconjuntos de células con capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación múltiple, que desempeñan un papel vital en el crecimiento tumoral, la metástasis y la recurrencia1,2. Actualmente, CSCs se han identificado para existir en una variedad de tumores malos, incluyendo pulmón, cerebro, páncreas, próstata, pecho, y cánceres del hígado3,4,5,6,7,8,9. La identificación de CSCs en estos tumores se basa principalmente en la presencia de proteínas superficiales del marcador, tales como expresión alta y/o baja de CD44, de CD24, de CD133, y deSca-1 9,10,pero un marcador único que pueda distinguir CSCs de no-CSCs no se ha divulgado hasta ahora. Actualmente, varias técnicas se utilizan para identificar y purificar CSCs en tejido del tumor o variedades de células del tumor. Estas técnicas están diseñadas en base a las propiedades específicas de los CSCs. Entre ellos, los ensayos y la clasificación de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos comúnmente utilizados.
Las células SP fueron descubiertas originalmente por Goodell et al.11,cuando caracterizaron células madre hematopoyéticas en células de médula ósea de ratón. Cuando las células de la médula del ratón fueron etiquetadas con el tinte fluorescente Hoechst 33342, un pequeño grupo de células Tenue-manchadas Hoechst 33342 apareció en el diagrama de dos dimensiones del punto de un análisis cytometry de flujo. Hoechst 33342 es un colorante de unión al ADN y tiene al menos dos modos de unión que conducen a diferentes características espectrales. Al ver la emisión de fluorescencia a dos longitudes de onda al mismo tiempo, se pueden revelar múltiples poblaciones12. En su ensayo, el Hoechst 33342 se excitó a 350 nm y la fluorescencia se midió utilizando el filtro de paso de banda (BP) de 450/20 nm y el filtro de borde de 675 nm de paso largo (EFLP)11. En comparación con toda la población de células de médula ósea, este grupo de células se enriqueció con células madre hematopoyéticas llamadas células SP11. Las células SP son capaces de expulsar rápidamente Hoechst 33342. La emanación de este tinte está relacionada con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC)13,que pueden ser inhibidos por algunos agentes como fumitremorgina C14,verapamilo y reserpina15,16. Después de eso, se detectaron diferentes proporciones de células SP en una variedad de tejidos, órganos, tejidos tumorales y líneas celularestumorales 17,18,19. Estas células SP tienen muchas características de las células madre17,19.
Este manuscrito describe el etiquetado y la coloración de Hoechst 33342 de las células cultivadas del tumor y el análisis de las células del SP por cytometry de flujo. Por otra parte, la optimización de la concentración de Hoechst 33342 y la selección apropiada del molde para una variedades de células específica del tumor usando este acercamiento se muestran. Finalmente, se demuestran los efectos de las señales de promoción o inhibición del stemness sobre la proporción de SP en las células tumorales. Los ejemplos experimentales demuestran que el análisis del SP se puede utilizar para explorar los efectos de varias señales, tales como expresión génica, pequeños inhibidores, activadores, cytokines, y chemokines, sobre stemness del tumor. En comparación con otros métodos para el aislamiento y la purificación de CSCs, tales como clasificación de CD44+/ CD24– población, análisis de aldehído deshidrogenasa (ALDH) y ensayos de formación de esfera tumoral, este método es más fácil de manipular y es rentable.
Hay varios puntos clave a tener en cuenta para el ensayo SP. La primera es la selección de un bloqueador adecuado, como verapamilo o reserpina, para cada línea celular, porque la ubicación de la “puerta” de las células SP se determina de acuerdo con la posición en la que un gran número de células SP desaparecen después de la adición del bloqueador. Para la línea celular MDA-MB-231, Reserpine funciona bien. Sin embargo, para otras líneas celulares, diferentes bloqueadores podrían funcionar mejor.
<p class=…The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de China 81572599, 81773124 y 81972787; Natural Science Foundation of Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundamental Research Funds for the Central Universities, Nankai University 63191153.
6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |