Представлен удобный, быстрый и экономичный метод измерения доли побочных популяционных клеток в сплошных опухолевых клеточных линиях.
Раковые стволовые клетки (CSC) являются важной причиной роста опухоли, метастазирования и рецидива. Выделение и идентификация ЦСК имеют большое значение для исследования опухолей. В настоящее время для идентификации и очистки ЦСК из опухолевых тканей и опухолевых клеточных линий используется несколько методик. Разделение и анализ клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов. Методы основаны на способности CSC быстро вытеснять флуоресцентные красители, такие как Hoechst 33342. Отток красителя связан с транспортерами АТФ-связывающей кассеты (ABC) и может ингибироваться ингибиторами транспортера ABC. Описаны методы окрашивания культивируемых опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализа доли их SP-клеток методом проточной цитометрии. Этот анализ удобен, быстр и экономичен. Данные, полученные в этом анализе, могут способствовать лучшему пониманию влияния генов или других внеклеточных и внутриклеточных сигналов на свойства стволов опухолевых клеток.
Раковые стволовые клетки (CSC) представляют собой подмножества клеток с способностью к самообновлению и множественным дифференцировыванием, которые играют жизненно важную роль в росте опухоли, метастазировании и рецидиве1,2. В настоящее время было идентифицировано, что CSC существуют при различных злокачественных опухолях, включая рак легких, головного мозга, поджелудочной железы, предстательной железы, молочной железы и печени3,4,5,6,7,8,9. Идентификация CSC в этих опухолях в основном основана на присутствии поверхностных маркерных белков, таких как высокая и / или низкая экспрессия CD44, CD24, CD133 и Sca-19,10,но уникальный маркер, который может отличить CSC от не-CSC, до сих пор не сообщалось. В настоящее время несколько методов используются для выявления и очистки ЦСК в опухолевой ткани или клеточных линиях опухоли. Эти методы разработаны на основе специфических свойств CSC. Среди них анализы и сортировка клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов.
SP-клетки были первоначально обнаружены Goodell et al.11,когда они характеризовали гемопоэтические стволовые клетки в клетках костного мозга мыши. Когда клетки костного мозга мыши были помечены флуоресцентным красителем Hoechst 33342, небольшая группа клеток Hoechst 33342 с тусклым окрашиванием появилась на двумерном точечном графике анализа проточной цитометрии. Hoechst 33342 является ДНК-связывающим красителем и имеет, по меньшей мере, два режима связывания, которые приводят к различным спектральным характеристикам. При просмотре флуоресцентного излучения на двух длинах волн одновременно можно выявить несколько популяций12. В их анализе Hoechst 33342 возбуждался при 350 нм, а флуоресценция измерялась с помощью полосового фильтра 450/20 нм (BP) и 675 нм краевого фильтра длинных проходов (EFLP)11. По сравнению со всей популяцией клеток костного мозга, эта группа клеток была обогащена гемопоэтическими стволовыми клетками, называемыми SP-клетками11. КЛЕТКИ SP способны быстро вытеснять Hoechst 33342. Отток этого красителя связан с АТФ-связывающими кассетными (ABC) транспортерами13,которые могут ингибироваться некоторыми агентами, такими как ФумитреморгинС14,Верапамил и Резерпин15,16. После этого различные пропорции SP-клеток были обнаружены в различных тканях, органах, опухолевых тканях и опухолевых клеточных линиях17,18,19. Эти SP-клетки имеют много характеристик стволовых клеток17,19.
Эта рукопись описывает маркировку и окрашивание культивированных опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализ SP-клеток методом проточной цитометрии. Кроме того, показана оптимизация концентрации Hoechst 33342 и правильный выбор блокатора для конкретной линии опухолевых клеток с использованием этого подхода. Наконец, продемонстрировано влияние сигналов продвижения или ингибирования стволовойсти на долю SP в опухолевых клетках. Экспериментальные примеры демонстрируют, что анализ SP может быть использован для изучения влияния различных сигналов, таких как экспрессия генов, небольшие ингибиторы, активаторы, цитокины и хемокины, на стволовую опухоль. По сравнению с другими методами выделения и очистки ЦСК, такими как сортировка CD44+/ CD24– популяция, анализ альдегиддегидрогеназы (ALDH) и анализы образования опухолевой сферы, этот метод проще для манипуляций и является экономически эффективным.
Есть несколько ключевых моментов, которые следует иметь в виду для анализа SP. Во-первых, это выбор правильного блокиратора, такого как Верапамил или Резерпин, для каждой клеточной линии, потому что «затворное» расположение КЛЕТОК SP определяется в соответствии с положением, в котором бо?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Фондом естественных наук Китая 81572599, 81773124 и 81972787; Фонд естественных наук города Тяньцзинь (Китай) 19JCYBJC27300; Тяньцзиньская народная больница и Грант на совместные исследования Университета Нанькай 2016rmnk005; Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов, Нанькайского университета 63191153.
6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |